بررسی مطالعه رفتاری و الکتروفیزیولوژی در استفاده از پیوند سلول های استرومایی مغز استخوان به همراه عصاره زیتون در ترمیم عصب سیاتیک قطع شده در موش صحرایی

الموضوعات :

مصطفی معظمی گودرزی ¹ (دانشجوی دکترای زیست سلولی تکوینی جانوری دانشگاه علوم تحقیقات تهران)
نسیم حیاتی رودباری ² (گروه زیست شناسی . دانشکده علوم پایه . دانشگاه ازاد اسلامی . واحد علوم و تحقیقات .تهران. ایران)
غلامرضا کاکا ³ (عضو هیئت علمی دانشگاه بقیة الله)
کاظم پریور ⁴ (گروه زیست شناسی . دانشکده علوم پایه . دانشگاه ازاد اسلامی . واحد علوم و تحقیقات .تهران. ایران)

تاريخ الإرسال : 02 الأحد , رمضان, 1443 تاريخ التأكيد : 13 الثلاثاء , ذو الحجة, 1443 تاريخ الإصدار : 11 الأحد , ذو القعدة, 1445

الکلمات المفتاحية: "عصب سیاتیک", "موش صحرایی", "سلولهای استرومایی مغز استخوان", " عصاره زیتون", "ترمیم",

ملخص المقالة :

مواد روشها : بعدِ قطع عصب سیاتیک، موشهای صحرایی نر بالغ ، در 4 گروه 7 تایی تقسیم شدند.نرمال؛ رت های سالم بدون آسیب، کنترل؛ رت های قطع عصب سیاتیک بدون مداخله درمانی. گروه پیوند، رت هایی که توسط سلولهای استرومایی مغز استخوان همراه عصاره زیتون در محل قطع عصب درمان شدند.گروه تجربی، رت هایی که تزریق سلولهای استرومایی مغز استخوان محل اسیب درمان شدند. میزان بهبودی توسط شاخص فعالیت حسی حرکتی عصب سیاتیک، مطالعات الکتروفیزیولوژی ارزیابی گردید.یافته ها : در ارزیابی حرکتی عصب سیاتیک، گروه کنترل بازگشت به حالت طبیعی پایان هفته هشتم مشاهده نشد، گروه سلول درمانی همراه عصاره زیتون ترمیم در پایان هفته هشتم حاصل گردید. میزان عددی AMP هفته هشتم بعدِ ترمیم، در گروه سلول درمانی دارای شیب ملایمی است که نشانه روند بهبودی گروه سلول درمانی است.نتایج حاصل از شمارش تعداد رشته های عصبی در سطح 1000 میکرومتر مربع ، تعداد رشته های عصبی در گروه های سلول درمانی هفته هشتم بعدِ ترمیم، در مقایسه گروه کنترل و گروه غشاء کیتوسان _ ژلاتین افزایش داشته است. در پایان هفته هشتم بر اساس شاخص فعالیت حسی عصب سیاتیک ( تست Hot Plate)، روند ترمیم در گروه سلول درمانی به همراه عصاره زیتون نسبت به سایر گروهها مشهودتر بود.نتیجه گیری : با توجه به شواهد بدست آمده می توان نتیجه گرفت که پیوند سلول استرومایی سبب ترمیم عصب سیاتیک قطع شده می شود و هم چنین عصاره زیتون به همراه سلول های استرومایی موجب تسریع در روند ترمیم عصب سیاتیک می شود.

نص كامل:



مطالعه رفتاری و  الکتروفیزیولوژی  در استفاده از پیوند سلول های استرومایی مغز استخوان به همراه عصاره زیتون در ترمیم عصب سیاتیک قطع شده در موش صحرایی 

 

چکیده

سابقه هدف : این مطالعه اثر درمانی سلولهای استرومایی مغز استخوان همراه عصاره زیتون بر ترمیم عصب سیاتیک قطع شده موش صحرایی نر نژاد ویستار توسط بررسی رفتاری ،  الکتروفیزیولوژی ارزیابی شد.

مواد روشها : بعدِ قطع عصب سیاتیک، موشهای صحرایی نر در 4 گروه 7 تایی تقسیم شدند.

رت های سالم ، رت هایی قطع عصب سیاتیک بدون مداخله درمانی، رت هایی با سلولهای استرومایی مغز استخوان همراه عصاره زیتون در محل قطع عصب، رت هایی با تزریق سلولهای استرومایی مغز استخوان در محل آسیب درمان شدند.

میزان بهبودی بوسیله فعالیت حسی حرکتی عصب سیاتیک،  مطالعات الکتروفیزیولوژی ارزیابی گردید.

یافته ها : ارزیابی حرکتی عصب سیاتیک، گروه کنترل بازگشتِ حالت طبیعی در هفته هشتم مشاهده نشد، گروه سلول درمانی همراه عصاره زیتون در هفته هشتم ترمیم شد. میزان  AMP هفته هشتم بعدِ ترمیمِ گروه سلول درمانی با شیب ملایم  نشانه روند بهبودی گروه سلول درمانی است.

شمارش تعداد رشته های عصبی در سطحی برابر 1000 میکرومتر مربع ، تعداد رشته های عصبی گروه های سلول درمانی  هفته هشتم بعد ترمیم، مقایسه با گروه کنترل و گروه غشاءPLGA افزایش داشت. پایان هفته هشتم شاخص فعالیت حسی عصب سیاتیک ( تست Hot Plate)، روند ترمیم گروه سلول درمانی  همراه عصاره زیتون به سایر گروهها مشهودتر بود.

نتیجه گیری : پیوند سلول استرومایی مغز استخوان سبب ترمیم عصب سیاتیک  و عصاره زیتون همراه سلول های استرومایی مغز استخوان موجب تسریع ترمیم عصب سیاتیک می شود

کلمات کلیدی : سلولهای استرومایی مغز استخوان ، عصاره زیتون ، عصب سیاتیک، موش صحرایی

مقدمه:

امروزه یکی از معضلات اصلی در سراسر جوامع بشری اعم از صنعتی و غیرصنعتی با آن روبرو هستند،آسیب به سیستم اعصاب محیطی است(1-2). جراحت های ناشی از عوارض جنگ،حوادث رانندگی،سوانح شغلی،بلایای طبیعی مانند سیل،زلزله و مصدومیت های ورزشی که منجر به آسیب اعصاب محیطی می گردد،علاوه بر هزینه های سنگین درمان،پیامدهای ناگواری چون قطع عضو،معلولیت های مادام العمر،از دست دادن شغل و موقعیت اجتماعی را به همراه دارند. با توجه به تحقیقات انجام شده، سالانه بیش از 90 هزار نفر در سراسر دنیا دچار آسیب های ناشی از سیستم های عصبی می شوند(1). تخمین زده می شود که حداقل 10 هزار نفر از این تعداد به نوعی دچار آسیب به فیبرهای عصبی می شوند(2).  ساده ترین روش درمانی برای ترمیم صدمات ناشی از قطع عصب،اتصال دو انتهای عصب قطع شده توسط بخیه و یا چسب فیبرین است. اما این روش همیشه با موفقیت همراه نیست(3-4 ). به این ترتیب راه حل کاملاً رضایت بخشی برای حل این مسئله به گونه ای که شرایط بعد از ترمیم و در حد کاملاً طبیعی باشد وجود ندارد(5).

 البته در سیستم عصبی محیطی بر خلاف سیتم عصبی مرکزی،رشته های عصبی محیطی قادر به بازسازی و عصب دهی هدف های دیستال می باشند و این فرآیند بلافاصله بعد از جراحت آغاز می شود(5,6). 

توانایی خاص اعصاب محیطی برای رشد دوباره به سمت هدف به خصوصیت بازسازی گلیای آن یعنی سلول شوان بر می گردد. اعصاب محیطی بالغ فاقد جمعیت سلول بنیادی برای تولید گلیای جدید هستند. به جای آن سلول های شوان بالغ تمایز یافته دارای درجه بالای پلاستیسیتی در طول زندگی بالغ بوده و با ایجاد آسیب، غلاف میلین را از دست داده و با تمایز زدایی به حالت مشابه سلول های بنیادی یا پروژنیتور بر می گردند(7).

بر اساس یافته ها دیده شده است که زیتون در حفاظت از طناب نخاعی موش با آسیب ثانویه به دلیل افزایش در نفوذ نوتروفیل موثر است (6). تحقیقات نشان می دهد پلی فنلهای روغن زیتون دارای خواص آنتی اکسیدان و ضد التهابی است(5).

همچنین در این تحقیقات دیده اند که پلی فنول زیتون در موش در روند التهاب به عنوان زیر ساختاری از  TNF-α و IL-10 نقش دارد.  اثر محافظت نورونی روغن زیتون (VOOمربوط به پلی فنلهایی است که خاصیت آنتی اکسیدانی دارند.

هیدروکسی تیروزول ، اتیل اتر (HTEE)، تیروزول اتر اتیل (TEEهر سه ترکیبات ،  اثرات محافظت نورونی مشابه دارند (8)

همچنین دیده شده که اسید oleanolic ، ماسلینیک اسید ، uvaol و erythrodiol سه ماده اصلی در زیتون ، برگ درخت زیتون و روغن زیتون است . این سه ماده، خواص مختلفِی ، از جمله فعالیت ضد تومورالی، فعالیت ضد التهابی وحفاظت از آنتی اکسیدان را دارند ( در سال های اخیر محققین سعی دارند از پیوند های سلولی جهت جایگزینی بافت از دست رفته استفاده کنند. در این راستا از سلول های مختلف مانند سلول های قرمز مغز استخوان، فیبروبلاست ها، سلول های بنیادی فولیکول مو و سلول های شوان استفاده شده است(10-12).  عصب سیاتیک بلندترین و بزرگترین عصب بدن است. این عصب بعد از خروج از لگن در پشت باسن و ران به سمت پایین آمده و حس پوست پشت ران را تاًمین می کند. کمی بالاتر از زانو به دو شاخه تیبیال و پروتئال تقسیم شده و این شاخه ها تمامی حس و حرکت زانو پایین تر از آن را تاًمین می کنند. سلول های بنیادی به دلیل توانایی در تولید انواع سلول های جدید و بازسازی و ترمیم بافت ها در زمینه مهندسی بافت مورد توجه بسیاری از دانشمندان قرار گرفته است(14) صدمه به دستگاه عصبی محیطی (PNS) باعث هدایت فرایند سلولی است که منجر به فروپاشی کامل  بخش دیستال عصب در محل زخم، به نام والرین دژنریشن می شود.انحطاط والرین به طور معمول باعث ایجاد یک واکنش التهابی قوی در سلول های شوان می شود.سلول های شوان که در تماس نزدیک با عصب هستند جزو اولین بخش هایی است که به آسیب عصب واکنش نشان می دهند.آن ها تولید سیتوکین های التهابی را مانند TNF و IL-1aو IL-1B در عرض چند ساعت بعد از آسیب عصب القا می کنند.این مواد باعث القای بیان مواد واسطه دیگری به نام هایIL-6, GM-CSFوIL-10، هم در سلول های شوان و هم فیبروبلاست ها می گردد عصاره زیتون با داشتن موادی مثل پلی فنول در کاهش التهاب عصب اسیب دیده می توانند موثر باشد(11). 

 

دلایل و ضرورت این مطالعه:

هدف از این مطالعه ارزیابی استفاده از پیوند سلول هایی مغز استخوان به همراه عصاره زیتون در ترمیم عصب سیاتیک قطع شده در موش صحرایی پس از قطع و اتصال مجدد دو ناحیه پروگزیمال و دیستال عصب می باشد.

یکی از اهداف تحقیق بر روی سلول های استرومایی مغز استخوان (Bone Marrow Stromal Cell (BMSC)  ) استفاده از آن ها در کلینیک و جهت درمان بیماری ها و ضایعات مختلف بر بافت های بدن می باشد. اینکه این سلول ها چگونه در بافت میزبان می توانند سبب بهبود و رفع آسیب بافت ها گردند، در بین محققان مورد اختلاف است، برخی معتقدند که این سلول ها این عمل را توسط تولید برخی از فاکتورهایی که برای تحریک ترمیم بافت ضروری هستند،انجام می دهند(8).

امروزه مشخص شد که حضور برخی مواد شیمیایی مرسوم به عوامل نوروتروفیک در اطراف محل ضایعه سبب تقویت رشد آکسون و هدایت آن در مسیر صحیح می گردد. از این عوامل می توان به فاکتور رشد عصب (Nerve Growth Factor (NGF) ) ، فاکتور نوروتروفیک مشتق از مغز(BDNF)Brain-Derived Neurotrophic Factor) اشاره نمود(8,5).

 مطالعات که در مقاله K. R. Jessen   نشان می دهد نقش c-Jun  ژن ها در عملکرد سلولهای شوان جهت بازسازی میلین و سیستم عصب آسیب دیده بسیار مهم است. c-Jun ها ترمیم مجدد را ایجاد می‌کند که برای سرکوب طبیعی ژن های میلین پس از آسیب لازم است ،از جمله ژن های Pzero و پروتئین پایه میلین و ژن کد کننده فاکتور Egr2 رونویسی پرو میلین(Krox20). این عملکرد سرکوبگر c-jun و آن رابطه تقابلی با Egr2

(Krox20)  قبل از نقش آن در بازسازی آشکار شد و به این تصور کمک کرد که c-jun همراه با تعدادی از ژنها در تمایز میلین نقش کمتر ولی در  فعال کردن بازسازی تعمیر ژنها ، از طریق پاسخ سلول شوان به محافظت عصبی پاسخ و پاسخ به ناراحتی عصبی که شامل تغییرات در فنوتیپ و ترمیم عصب صدمه دیده می شود(9).

 

مواد و روش کار:

در این تحقیق از 28 سر موش صحرایی نر بالغ نژاد ویستار به وزن تقریبی 250-230 گرم استفاده شد که از انستیتو پاستور تهران تهیه شدند.حیوانات به صورت تصادفی به 4 گروه کنترل، نرمال،گروه سلول درمانی  و گروه سلول درمانی به همراه عصاره زیتون تقسیم گردیدند. در مدت تحقیق حیوانات در حیوان خانه دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم تحقیقات در شرایط نور، آب، غذای مناسب و قفس های پلاستیکی نگهداری شدند. در این تحقیق تمامی اصول اخلاقی کار با حیوان رعایت شده است.

جدا سازی و کشت سلول های استرومایی مغز استخوان: ابتدا موش های صحرایی بالغ نر به صورت تصادفی انتخاب شدند و پس از القاء بیهوشی توسط مخلوطی از کتامین به مقدار 90 و زایلازین به مقدار 10  و تثبیت حیوان بر روی سینی تشریح و برش پوست استخوان ران پای چپ حیوان نمایان شد. سپس توسط مته با قطر 1 میلی متر سوراخی در سطح خارجی استخوان ران ایجاد شد و با کمک سرنگ 5 میلی لیتری حاوی 1 میلی لیتر محیط  APha-MEM و سرم جنین گاوی(FBS)  10 درصد و یک سوزن18G مغز استخوان را از هر دو طرف  انتهای پروگزیمال و دیستال استخوان آسپیره کرده و تمام محتویات سرنگ را به درون یک فلاسک 25 سی سی تخلیه کرده و در انکوباتور :7.2 PH با دمای 37 درجه سانتی گراد و میزان CO2 ، 5 درصد و شرایط رطوبت برای مدت 24 ساعت نگهداری شدند. هنگام تعویض محیط توسط  PBS استریل انجام گردید،پس از آن تعویض محیط هر 2 تا 3 روز با تخیله کامل سلول های خونی و خونساز و پرشدن بیش از 80 درصد کف فلاسک اولیه ادامه یافت.هنگامی که تراکم سلول ها به 80 درصد کف فلاسک رسید، توسط Trypsin 0.025% و EDTA 0.04% پاساژ داده شده اند،این عمل تا دو پاساژ ادامه یافت،در این شرایط سلول ها از یک مرفولوژی دوکی شکل یکسانی برخوردار شده اند ( شکل 1 ).

 

 

شکل 1. تصویر میکروسکوپی سلولهای استرومایی مغز استخوان 24 ساعت بعد از پاساژ 2 . بزرگنمایی 100 ×

طریقه شمارش سلول های BMSC در سوسپانسیون حاوی سلول های BMSC به کمک لام نئوبار :

 با استفاده از سمپلر مقدار 10 لاندا از سوسپانسیون حاوی سلول BMSC برداشته و با 10 لاندا تریپان بلو ترکیب شده .سپس 10 لاندا از محلول بدست آمده جهت شمارش سلولی در زیر لام نئوبار قرار گرفت،سلول ها در هر 4 مربع 16 خانه ای لام نئوبار شمارش شده و پس از میانگین گرفتن از تعداد سلول ها عدد بدست آمده در 20000 ضرب گردید تا تعداد سلول ها در حجم 1 سی سی محیط کشت به دست آید ( شکل 2).

 

 

شکل2. تصویر میکروسکوپی سلولهای استرومایی مغز استخوان در لام نیوبار با بزرگنمایی 400. پیکان سیاه رنگ BMSC  زنده، پیکان آبی    رنگ هایBMSC  مرده رنگ گرفته با تریپان بلو.

 

جهت بررسی خلوص سلول های استرومایی مغز استخوان: در این ارزیابی از رنگ آمیزی ایمونوسایتوشیمی انجام شد و برای این منظور از آنتی بادی اولیه فیبرونکتین و CD44 استفاده گردید. ابتدا پلیت های مورد نظر با PBS به مدت 5 دقیقه شست و شو داده شد، سپس سلول ها محلول 4% پارافرمالدئید به مدت نیم ساعت ثابت شده و پس از شست و شوی مجدد با PBS و افزودن محلول بلاک کننده به مدت یک ساعت در دمای اتاق و شست و شوی مجدد، آنتی بادی اولیه به مدت یک شب بر روی سلول ها ریخته شد. پس از شست و شوی آنتی بادی ثانویه بیوتین اویدین متصل به آنزیم Peroxidase و رنگ DAB برای رنگ آمیزی سلول ها استفاده و در انتها، شست و شو با PBS انجام شد ( شکل 3).

 

                

شکل3. تصویر میکروسکوپی سلولهای استرومایی، پس از انجام ایمونوسیتوشیمی با بزرگنمایی 400 ×A,   ، B ،C به ترتیب مربوط به آنتی بادی اولیه فیبرونکتین، آنتی CD44 و کنترل منفی سلولهای تمایز نیافته BMSC در پایان پاساژ دوم.

 

پس از قطع عصب سیاتیک پای راست حیوان موش ها به طور تصادفی در 4 گروه تقسیم شدند: 1. گروه نرمال : بدون هیچ آسیبی به عصب سیاتیک 2. گروه کنترل: قطع عصب سیاتیک بدون هیچ مداخله ای،3. گروه تجربی1: تزریق 100 هزار سلول استرومایی مغز استخوان توسط سرنگ همیلتون در محل قطع عصب، 4. گروه تجربی 2 : : تزریق 100 هزار سلول استرومایی مغز استخوان در محل ضایعه به همراه تزریق داخل صفاقی عصاره زیتون

ارزیابی حرکتی با تست فوت پرینت:  در پایان هفته های دوم ، چهارم، ششم و هشتم بعد از عمل جراحی ، به منظور ارزیابی میزان بهبود حرکتی تست رفتاری foot print انجام شد. این آزمون روشی در جهت ارزیابی بالینی میزان بازگشت عملکرد حرکتی عصب ترمیم شده می باشد.(12) که در ابتدا کف پای مربوط به عصب قطع شده حیوان با جوهر رنگی شده است ، سپس حیوان بر روی کاغذ سفیدی که در کف راهرویی به ابعاد 60 ×20×7 سانتی متر راه می رود ، سپس SFI بر اساس فرمول زیر برای پای جراحی شده و پای سالم محاسبه گردید.

 

شکل 4 – نمایش کف پای رت

 

PL   نشان دهنده طول کف پا، TS نشان دهنده فاصله بین سرانگشتان 1و 5 ، IT نشان دهنده فاصله بین سرانگشتان 2و 4 ( شکل 4)

اعداد بین 100- الی 10- مسیر بهبودی حرکتی را نشان می دهند، عدد 100- به معنای قطع کامل عصب و نتایج اعداد بین 10- تا 10+ علامت طبیعی بودن حرکت پای حیوان می باشد. این روش بهترین ارزیابی برای سنجش رفتار حرکتی می باشد. (14-16).

ارزیابی شاخص عملکرد حسی عصب سیاتیک : در هفته های 2 و 4 و 6 و 8 بعد از عمل جراحی ، جهت ارزیابی حسی عصب سیاتیک از تست رفتاری (Hot Plate) که روشی برای سنجش درک حس درد در حیوانات می باشد ، استفاده شد. دستگاه مورد استفاده (Heater) ساخت شرکت پارس آزما – اصفهان-ایران بود. که با یک پیچ تنظیم درجه حرارات آن در 48 درجه سانتیگراد ثابت گردید . در این روش رت روی صفحه قرار گرفت . مدت زمانی که طول کشید تا حیوان پای مجروح خود را ار روی سطح بلند کند به عنوان زمان پاسخ در نظر گرفته شد. این عمل برای هر حیوان سه بار به طور جداگانه و به فواصل ده دقیقه ای انجام گرفت و میانگین این سه بار به عنوان پاسخ حیوان ثبت شد. ( 17)

مطالعات الکترومیوگرافی: در پایان هفته هشتم موشهای هر گروه از طریق داخل صفاقی کاملا بیهوش شدند. در طول دوره بیهوشی دمای بدن موشها با استفاده از لامپ حرارتی در حد دمای اطاق ( 30 درجه سانتیگراد ) کنترل شد . پس از برش پوست و بافت های عضلانی عصب سیاتیک را در سمت جراحی شده مشاهده شد. ضمن تست نمودن دستگاه ثبت الکترومیوگرافی ، تحریک کننده سوزنی روی تنه عصب ( بالاتر از محل ضایعه اصلی ) قرار گرفت. برای ثبت تغییرات پتانسیل ناشی از تحریک ، دو الکترود کفه ای ، یکی بر روی عضله گاستروکنیموس و دیگری یک سانتیمتر زیر برجستگی تیبیا فرو برده شد.برای ثابت نگه داشتن فاصله بین الکترودهای سوزنی و کفه ای به دقت اندازه گیری شد. با روشن نمودن دستگاه تغییرات پتانسیل دریافتی به هر نمونه پس از عبور از تقویت کننده توسط نوسان نگار ثبت گردید. ابتدا از عضله گاستروکنیموس – سولیوس در حالت استراحت الکترومیوگرافی بدست آمد. وقتی عضله از لحاظ عصب گیری سالم باشد هیچ گونه فعالیت الکتریکی در حالت استراحت در آن وجود ندارد که اصطلاحا به آن سکوت الکتریکی می گویند.

سرعت هدایت پیام عصبی (NCV) و دامنه پتانسیل فعالیت حرکتی (AMP) ، جهت بررسی و تجزیه و تحلیل ثبت گردید.

 

تجزیه و تحلیل داده ها: نتایج با استفاده از نرم افزار SPSS 23 و آنالیز واریانس یک طرفه (One-Way Anova) و تست Tukey مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفتند و P<0.05 به عنوان سطح معنی دار در نظر گرفته شد و نیز نمودار های مربوطه با نرم افزار2017 Microsoft Excel ترسیم شدند.

 

نتایج:

در تحقیق حاضر بعد از قطع عصب سیاتیک، هیچ کدام از حیوانات توانایی راه رفتن بر روی کف پای آسیب دیده را نداشتند. در ارزیابی حرکتی عصب سیاتیک براساس قانون Beain  و همکاران، 100- به معنای قطع کامل عصب و 10- تا 10+ نمونه طبیعی می باشد. در گروه کنترل با توجه به اعداد بدست آمده، بازگشت به حالت طبیعی در پایان هفته هشتم مشاهده نشده است، اما در گروه سلول درمانی به همراه عصاره زیتون ترمیم در پایان هفته هشتم حاصل گردید، در مقایسه با گروه کنترل ، در واقع روند بهبودی در گروه سلول درمانی به همراه عصاره زیتون در مقایسه با گروه سلول درمانی بدون عصاره زیتون در پایان هفته هشتم سریع تر بوده است ( نمودار شماره 1). میانگین تاخیر پاسخ حسی در پایان هفته هشتم پس از ترمیم در گروههای سلول درمانی نسبت به گروه کنترل در مقایسه با گروه نرمال از نظر عددی روند مثبتی را نشان داد، که این اتفاق بیانگر روند ترمیم و بازگشت عملکرد حسی عصب سیاتیک در گروههای سلول درمانی در مقایسه با گروه کنترل می باشد ( نمودار شماره 2). همچنین در پایان هفته هشتم از تمام گروه های مورد آزمایش سنجش الکتروفیزیولوژی به عمل آمد، همانطور که می دانیم با استفاده از میزان AMP می توان مقدار تخریب و ترمیم آکسون ها را به دست آورد. همچنین با توجه به میزان عددی NCV می توان میزان بهبودی در روند میلین سازی را به دست آورد.

میزان عددی AMP در هفته هشتم پس از ترمیم، در گروه سلول درمانی دارای شیب ملایمی است این امر نشان دهنده روند بهبودی در گروه سلول درمانی است، روند بهبودی در گروه سلول درمانی به همراه عصاره زیتون  نسبت به گروه کنترل و گروه سلول درمانی فاقد عصاره زیتون  بهتر بوده و به نمونه نرمال نزدیک تر شده است( نمودار شماره 3 ). همچنین اتفاقی مشابه به نتایج بررسی AMP در بررسی آماری NCV مشاهده گردید. با توجه به میزان عددی نتایج NCV در بررسی الکتروفیزیولوژی ، گروه سلول درمانی به همراه عصاره زیتون نسبت به سایر گروهها ترمیم بهتری در میلین سازی رشته های عصبی مشاهده گردید ( نمودار شماره 4 ).

 

 

نمودار1.

ارزیابی شاخص عملکرد حرکتی عصب سیاتیک ( sciatic function index=sfi ) در پایان هفته هشتم بعدترمیم درگروههای مورد آزمایش 

در پایان هفته هشتم پس از ترمیم ، میزان عددی SFI در گروههای سلول درمانی در مقایسه با گروه کنترل نشان از روند بهبودی و نزدیک شدن به حالت طبیعی ( SFI در حد فاصل +10  و -10 ) و گروه نرمال می باشد. توانایی راه رفتن در پای جراحی شده در گروه سلول درمانی( E1) ، علی الخصوص در گروه سلول درمانی به همراه عصاره زیتون( E2) در پایان هفته هشتم ایجاد گردید. گروه سلول درمانی دارای اختلاف معنی دار با گروه نرمال می باشد که این اختلاف معنی دار در گروه سلول درمانی با عصاره زیتون با گروه نرمال وجود ندارد.

 

 

نمودار2.

آزمون حسی با استفاده از تست Hot Plate  در گروههای مورد آزمایش در پایان هفته های 2 ، 4، 6 و 8 بعد از جراحی.

با افزایش زمان میزان درک حس حرارت در گروههای سلول درمانی(E1) در مقایسه به گروه کنترل بیشتر شده است. یا به عبارت دیگر آستانه تحمل با گذشت زمان کاهش یافته است. در گروه سلول درمانی همراه عصاره زیتون(E2) مقدار آستانه تحمل بهتر شده است و به عدد نرمال نزدیک تر است.

محور افقی زمان(هفته های 2و4و6و8) و محور عمودی میزان واکنش 4 گروه مورد آزمایش نسبت به تست گرما(HOT PLATE) را نشان می دهد.

 

 

 

نمودار3.

نتایج AMP(Amplitude Muscle Action Potential) (دامنه پتانسیل فعالیت حرکتی)در هفته هشتم پس از جراحی در گروههای مورد آزمایش.

با توجه به نمودار و مقدار عددی AMP ، میزان ترمیم آکسون در گروههای سلول درمانی همراه با عصاره زیتون(E2) نسبت به سایر گروهها بهتر می باشد.محور افقی نوع گروه ها و محور عمودی میزان تغییرات عددی در تست AMP را نشان می دهد. (E1) نیز مشابه نمودارهای قبلی نشانه گروه سلول درمانی است.

 

 

 

نمودار 4

نتایج سرعت هدایت عصبی NCV(Nerve conduction velocity)  در هفته هشتم پس از ترمیم ئر گروههای مورد آزمایش.

با توجه به نمودار و مقدار عددی NCV ، میزان ترمیم میلین در گروههای سلول درمانی نسبت به گروه کنترل بهتر می باشد. از لحاظ آماری بین گروه کنترل و نرمال اختلاف معنی دار وجود دارد. اما هیچ اختلاف معنی داری بین گروههای سلول درمانی(E1) با سایر گروهها دیده نشد. روند ترمیم میلین در گروه سلول درمانی به همراه عصاره زیتون(E2) نسبت به گروه سلول درمانی بدون تزریق عصاره زیتون بهتر می باشد.

محور افقی نشانه گروه ها و محور عمودی میزان هدایت عصبی در چهار گروه را نشان می دهد.

 

بحث:

در تحقیق حاضر نشان داده شد که در پایان هفته هشتم ترمیم و انجام الکترومیوگرافی بر روی حیوانات با بررسی میزان AMP مشاهده شد که، مقدار AMP در گروه سلول درمانی رشد قابل ملاحظه ای در مقایسه با گروه کنترل داشته و این میزان به نمونه نرمال در حال نزدیک شدن می باشد که این اتفاق می تواند در مورد ترمیم عصب قطع شده در هفته هشتم پس از ترمیم، در ترمیم آکسون ها حائز اهمیت باشد هم چنین اندازه گیری AMP می تواند اطلاعاتی در مورد کانال های سدیم و پتاسیم در عصب ارائه دهد. به طور حتم میزان AMP با محل و میزان سدیم در کانال های موجود در عصب مرتبط است و با استفاده از میزان AMP می توان مقدار تخریب و ترمیم آکسون ها را مشاهده کرد(17). در این رابطه می توان به پژوهش های معظمی و همکاران(17)  و تاجیک و همکاران (18) اشاره کرد که در هر دو مورد در گروه سلول درمانی در پایان هفته هشتم پس از ترمیم، مقدار AMP به نمونه نرمال نزدیک شده که این خود بیانگر روند ترمیم عصب آسیب دیده و ترمیم آکسون ها می باشد. در بررسی ترمیم اعصاب محیطی، تعداد آکسون های ترمیم شده از لحاظ تعداد، میلین دار شدن و بررسی کیفیت غلاف میلین ترمیم شده مد نظر قرار می گیرد(22 - 21). cuevas و همکاران نشان دادند که در صورت تزریق سلول های BMSC تمایز نیافته به محل عصب سیاتیک قطع شده درصدی از این سلول ها به سلول میلین ساز تبدیل شده و در ترمیم بافت آسیب دیده کمک می نماید و میلین سازی در میزان NCV و ترمیم آکسون ها و میزان  AMP حائز اهمیت است(19). هم چنین LOPEZ و همکاران در طی تحقیقی تاثیر مثبت سلول های استرومایی مغز استخوان در روند ترمیم عصب سیاتیک و افزایش تعداد آکسون ها نسبت به گروه کنترل را نشان دادند(20). افزایش AMP نشان از ترمیم آکسون ها در عصب سیاتیک آسیب دیده می باشد که مطالعه بافت شناسی و هم چنین شمارش تعداد رشته های عصبی این مطلب را تاًیید می کند. در تحقیق حاضر در پایان هفته هشتم پس از جراحی تعداد رشته های عصبی در گروه سلول درمانی در مقایسه با گروه کنترل افزایش داشته، اما در مقایسه با گروه نرمال اختلاف معنی دار وجود دارد. افزایش تعداد رشته های عصبی در پایان هفته هشتم بیانگر روند ترمیم در گروه سلول درمانی نسبت به سایر گروه ها می باشد. مطالعات رفتاری و الکتروفیزیولوژی نیز این مسئله را تاًیید می کند که با گذشت زمان روند ترمیم در گروه سلول درمانی پیشرفت بهتری نسبت به گروه های دیگر دارد. در این رابطه معظمی و همکاران با تزریق سلول های استرومایی مغز استخوان در عصب آسیب دیده نتیجه گرفتند که سلول BMSC می تواند باعث افزایش تعداد رشته های عصبی در عصب له شده باشد. هم چنین DEZAWA و همکاران نشان دادند که با انتقال سلول های استرومایی مغز استخوان به محل عصب قطع شده، ترمیم عصب انجام می گیرد و تعداد رشته های عصب افزایش پیدا می کند(21). HOU و همکاران بیان کردند که پیوند سلول های استرومایی مغز استخوان که توسط ترکیبی از فاکتور های رشد از جمله فاکتور رشد گلیال متمایز شده باشد به محل عصب قطع شده ای که 2 سر آن توسط لوله ای که محتوی رشته های پلیمری به هم متصل شده باشد می تواند سبب ترمیم عصب دو ناحیه قطع شده گردد(22). پیوند سلولی، به عنوان یک رویکرد درمانی جدید برای نقایص عصب محیطی شناخته می شود. سلول های پیوندی ایده آل باید به آسانی قابل دسترس بوده، در کشت تکثیر شده و با تحمل ایمونولوژیکی، در بافت میزبان ادغام شوند(19). پیوند سلولی، موجب رشد و تحریک بازسازی رگ های خونی و جوانه های عصبی می شود(12).  

نتیجه گیری:

با توجه به شواهد بدست آمده می توان نتیجه گرفت که پیوند سلول استرومایی سبب ترمیم عصب سیاتیک قطع شده می شود و هم چنین عصاره زیتون به همراه سلول های استرومایی موجب تسریع در روند ترمیم عصب سیاتیک می شود که با مطالعات الکتروفیزیولوژی و بررسی رفتاری SFI و بررسی شاخص حسی عصب سیاتیک ( Hot Plate) آن را نشان داد.

 

منابع:

 

 

1. He C‚ Chen Z‚ Chen Z. Enhancement of motor nerve regeneration by nerve growth

factor. Microsurgery 1992; 13(3): 151-154.

2. Abe N, Cavalli V. Nerve injury signaling. Cur Opin Neurobiol. 2008; 18(3): 276-283.

3.Mahesh CD. Bioengineered scaffolds for peripheral nerve regeneration.in partial fulfillment of the requirement for the degree doctor of philosophy in the school of bioengineering. Department of biomedical engineering Georgia institute of technology: May 2007:34-9

4.Yang Y, Ding F, Wu J, et al. Development and evaluation of silk fibroin- based nerve grafts used for peripheral nerve regeneration. Biomaterials 2007;28(36):5526-35. 

5.Frisen J. Determinants of axonal regeneration. Pistol Histopathol.1997;12:857–868.

6.Carswell EA, Old LJ, , et al. "An endotoxin-induced serum factor that causes necrosis of tumors" Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1975;72 (9): 3666–70.

7. Allan D. Levi, S. Shelby Burks, et al. The Use of Autologous Schwann Cells to Supplement Sciatic Nerve Repair With a Large Gap: First in Human Experience. All rights reserved. DOI: http://dx.doi.org/10.3727/096368915X690198  Copyright 2016 Cognizant, LLC.

 

8.  Old LJ. "Tumor necrosis factor (TNF)". Science.1985; 230 (4726): 630–2.

9. K. R. Jessen and R. Mirsky. The repair Schwann cell and its function in regenerating

Nerves. 2016 The Authors. The Journal of Physiology published by John Wiley & Sons Ltd on behalf of The Physiological Society. J Physiol 594.13 (2016) pp 3521–3531

10.Ren z, wang y, , et al, Role of stem cells in the regeneration and repair of peripheral nerves. rev neurosis 2012:23(2):135-43.

11.Kawada h, fujito j, Kinjo k.et al. Nonhematopoietic mesenchymal stem cell can be mobilized and different into cardiomyocyte after myocardial infarction. Blood 2004: 104(12):3581-7.

12. Cui l, jiang j , wei l, et al. Transplantation of embryonic stem cells improves nerve repair and functional recovery after severe sciatic axotomy. Stem cells 2008 ; 26(5) :1356-65.

13.Teixeira AI, Abrams GA, et al. Epithelial contact guidance on well-defined microand nanostructured substrates. J Cell Sci. 2003;116(3):1881-92.

14.Jayaraman K, Kotaki M, Zhang YZ. Recent advances in polymer nanofibers. J Nanosci Nanotechnol. 2004; 4: 52– 65.

15.Cho Y, Shi R, Borgens RB. Chitosan produces potent neuroprotection and physiological recovery following traumatic spinal cord injury. J Exp Biol 2010; 213(Pt 9): 1513-20.

16.Muzzarelli RA, Mattioli-Belmonte M, , et al. Biochemistry, histology and clinical uses of chitins and chitosans in wound healing. EXS 1999; 87: 251-64.

17. Moazami, J Mazand Univ Med Sci 2013; 23(102): 96-105 (Persian).

18.Tajik,Birjand Univ Med Sci 2013 ; 4 (20), (Persian)

19.Cuevas P, Carceller F, et al. Peripheral nerve regeneration by bone marrow stromal cells. Neurol Res 2002; 24: 634-638.

20. Pereira Lopes FR, Camargo de Moura Campos L, et al. Bone marrow stromal cells and resorbable collagen guidance tubes enhance sciatic nerve regeneration in mice. Exp Neurol 2006; 198: 457-468.

21.Dezawa M, Takahashi I, , et al. Sciatic nerve regeneration in rats induced by transplantation of in vitro differentiated bone marrow stromal cells. Eur J Neurosci 2001; 14: 1771-76.

 

22.Hou SY, Zhang HY, et al. Tissue-engineered peripheral nerve grafting by differentiated bone marrow stromal cells. Neuroscience 2006; 140: 101-110.

 

 

16

 

---