کلون‌سازی و بیان سیتوپلاسمی L-آسپاراژیناز II در باکتری اشریشیا کلی

الموضوعات :

حسین مهبودی ¹ (دانشگاه آزاد اسلامی، واحد قم، گروه میکروبیولوژی)
منصور عباچی ² (بخش تحقیق و توسعه، شرکت تحقیقاتی تولیدی سیناژن)
شهرام عراقی ³ (بخش تحقیق و توسعه، شرکت تحقیقاتی تولیدی سیناژن)
هاله حامدی فر ⁴ (بخش تحقیق و توسعه، شرکت تحقیقاتی تولیدی سیناژن)
بهروز وزیری ⁵ (مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی، واحد پروتئین نوترکیب، انستیتو پاستور ایران)
فریدون مهبودی ⁶ (مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی، واحد پروتئین نوترکیب، انستیتو پاستور ایران)

تاريخ الإرسال : 01 السبت , جمادى الثانية, 1431 تاريخ التأكيد : 04 الجمعة , شعبان, 1431 تاريخ الإصدار : 19 الخميس , رجب, 1431

الکلمات المفتاحية: ال- آسپاراژینازII, اشریشیا کلی, کلونسازی, بیان ژن,

ملخص المقالة :

سابقه و هدف: ال-آسپاراژیناز (تیپ II) با فعالیت ضدتوموری به طور طبیعی توسط باکتری اشریشیا کلی تولید می‌گردد. این آنزیم با تبدیل ال- آسپاراژین موجود در خون به آمونیوم و آسپارتیک اسید، در درمان لوکمیای لمفوبلاستیک حاد (ALL) مورد استفاده قرار می‌گیرد. هدف از این پژوهش، تولید سیتوپلاسمی آنزیم ال- آسپاراژیناز II و کلون‌سازی ژن آن بدون سیگنال پپتید و حذف متیونین ابتدایی بود. مواد و روش‌ها: در ابتدا ژن ال- آسپاراژیناز II با روش PCR از اشریشیا کلی سویه K12 جداسازی و درون وکتور بیانی pET32 مهندسی شده کلون گردید. توالی‌یابی و ارزیابی بیان ژن مورد نظر مطابق با روش‌های متداول به انجام رسیدند. سپس پلاسمید نوترکیب حاوی ژن متیونین آمینوپپتیداز خالص سازی گردید و با روش شوک حرارتی به درون باکتری تولید کننده آسپاراژیناز نوترکیب انتقال داده شد. یافته‌ها: بیان ال- آسپاراژیناز سیتوپلاسمی بیش از نوع پری‌پلاسمی بود. همچنین با توجه به بیان بالای آنزیم متیونین آمینوپپتیداز در میزبان بیانی اشریشیا کلی Origami، انتظار می‌رود که این آنزیم به طور مؤثری توانسته موجب حذف متیونین ابتدایی ال- آسپاراژیناز شود. نتیجه‌گیری: نتایج به دست آمده در این مطالعه در راستای معرفی میزبان با قابلیت بیان بالای ال- آسپاراژیناز نوترکیب در سیتوپلاسم، می‌تواند گامی بزرگ در مسیر درمان لوکمی لنفوبلاستیک حاد و نیز افزایش تولید این آنزیم در صنعت محسوب گردد.

المصادر:

1. Kotzia GA, Labrou NE. L-Asparaginase from Erwinia chrysanthemi 3937: cloning, expression and characterization. J. Biothechnol. 2007; 127: 657-669.

2. Aghaiypour K, Wlodawer A, Lubkowski J. Do bacterial L-asparaginase utilize a catalytic triad Thr-Tyr-Glu?. J. Biochem. Biophys. Acta. 2001; 1550: 117-128.

3. Aghaiypour K, Wlodawer A,  Lubkowski J. Structural basis for the activity and substrate specificity of Er. chrysanthemi L- asparaginase. J. Biochem. 2001; 40: 5655-5664.

4. Afrasiabi R, Aghaiypour K, Kafilzadeh F, Safaviyeh S. Cloning, sequence analysis, and expression of L-asparaginase obtained from Erwinia chrysanthemi. Jouenal of Microbial World. 2010; 3(1): 7-15.

5. Lubkowski J, Palm G, Gilliland Gary L, Derst CH, Rohm K, wlodawer A. Crystal structure and amino acid sequence of Wolinella succinogenes L-asparaginase. J. Biochem. 1996; 241: 201-207.

6. Harms E, Wehner A, Aung HP٫ Rohm KH. A catalytic role for threonine-12 of E.coli asparaginaseII as established by site-directed mutagenesis. FEBS. 1991; 285: 55-58.

7. Ferrara MA, Severino NMB, Mansure JJ, Martins AS, Oliveira EMM, Siani AC, Pereira N, Torres FAG, Bon EPS. Asparaginase production by a recombinant Pichia pastoris strain harbouring Saccharomyces cervisiae Asp3 gene. Enzyme Microb. Tech. 2006; 39: 1457-1463.

8. Youssef MM, Al-Omair MA. Cloning, purification, characterization and immobilization of l-asparaginase II from E. coli W3110. Asian J. Biochem. 2008; 3 (6): 337-350.

9. Ward KR, Adams GDJ, Alpar HO, Irwin WJ. Protection of the enzyme L-asparaginase during lyophilisation–a molecular modelling approach to predict required level of lyoprotectant. J. Pharmaceutics. 1999; 187: 153-162.

10. Zhang YQ, Zhou WL, Shen WD, Chen YH, Zha XM, Shirai K, Kiguchi K. Synthesis, characterization and immunogenicity of silk fibroin–L-asparaginase bioconjugates. J. Biotechnol. 2005; 120: 315-326.

11. Rusel D, Sambrook J. Molecular cloning A laboratory Manual. Third edition ٫Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.

12. Nakahama K, Imada A, Igarasi S, Tubaki K. Formation of L-Asparaginase by Fusarium Species J Gen Microbiol. 1973; 75: 269-273.

13. Jennings MP, Beacham IR. Analysis of the Escherichia coli gene encoding L-asparaginase II ansB and its regulation by cyclic AMP receptor and FNR proteins. J. Bacteriol. 1990; 172: 1491-1498.

14. Jeristrom PG, Liu J, Beacham IR. Regulation of E. coli l-asparaginase II and 1-aspartaseby the fnr gene product. FEMS Microbiol. Lett. 1989; 41: 127-130.

15. Roberts J, Bursonand G, Hill JM. New procedures for purification of L-asparaginase with high yield from Escherichia coli. J. Bacteriol. 1968; 95: 2117-2123.

16. Khushoo A, Pal Y, Singh BN, Mukherjee KJ. Extracellular expression and single step purification of recombinant Escherichia coli L-asparaginase II. Protein Expression Purificat. 2004; 38: 29-36.

17. Avramis VI, Panosyan EH. Pharmacokinetic/pharmacodynamics relationships of asparaginase formulations: The past, the present and recommendations for the future. Clin. Pharmacokinet. 2005; 44: 367-393.

18. Verma N, Kumar K, Kaur G, Anand S. L-asparaginase: A promising chemotherapeutic agent. Crit. Rev. Biotechnol. 2007; 27: 45-62.

19. Maita T, Morokuma K, Mastuda G. Amino acid sequence of L-asparaginase from E.coli. J. Biochem. 1974; 76: 1351-1354.

20. Corena CP,  Lupescu I, Vatafu I, Caraiani T, Savoiu VG, Campeanu GH, Grebenisan I, Negulescu GHP, Constantinescu D. Production of L-asparaginase II by recombinant Escherichia coli cells. Roum. Biotechnol. Lett. 2002; 7(3): 717-772.