مطالعه بیان پروتئین core+1 ویروس هپاتیت C توسط روش میکروسکوپی هم کانون

الموضوعات :

حسن نوربازرگان ¹ (دانشگاه آزاد اسلامی، واحد لاهیجان، گروه میکروبیولوژی)
عطیه هاشمی ² (گروه هپاتیت و ایدز، انستیتو پاستور ایران)
محمدرضا آقاصادقی ³ (گروه هپاتیت و ایدز، انستیتو پاستور ایران)
آرش معمارنژادیان ⁴ (گروه هپاتیت و ایدز، انستیتو پاستور ایران)
مهدی آسمار ⁵ (دانشگاه آزاد اسلامی واحد لاهیجان، گروه میکروبیولوژی)
فرزین روحوند ⁶ (بانک ژن نوترکیب ایران، انستیتو پاستور ایران)

تاريخ الإرسال : 29 الأربعاء , ذو الحجة, 1430 تاريخ التأكيد : 29 الجمعة , محرم, 1431 تاريخ الإصدار : 15 الجمعة , محرم, 1431

الکلمات المفتاحية: هپاتیت C, پروتئین Core+1, سلول Huh7,

ملخص المقالة :

سابقه و هدف: پروتئین جدیدی تحت عنوان پروتئینF یاcore+1 شناخته شده است که توسط ژنوم ویروس هپاتیت C (HCV) کد می‌شود. عملکرد این پروتئین هنوز مشخص نشده است، اما به‌نظر می‌رسد در سیکل زندگی و بیماری‌زایی ویروس قش مهمی را داشته باشد. در این مطالعه کلون کردن و بیان ژن HCV core+1 در سیستم یوکاریوتی مورد بررسی قرار گرفت تا نقش این پروتئین در مسیرهای سیگنالینگ سلولی و مقاومت ویروس به درمان بررسی گردد. مواد و روش‌ها: ابتدا ژن core+1 داخل پلاسمید pIVEX2.3 به‌عنوان یک ناقل پروکاریوتی کلون شد. در ادامه توالی نوکلئوتیدی 6XHis-tag core+1 حاصل از واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز (PCR) در سایت‌های آنزیمی NheI/BamHI داخل وکتور یوکاریوتی pcDNA3.1(+) کلون شد. این پلاسمید به‌وسیله تجزیه آنزیمی و توالی‌یابی مورد تائید قرار گرفت. پس از ساخته شدن رده سلول کبدی Huh7 به وسیله روش الکتروپوریشن و لیپوفکشن ترانسفکت شدند. با ترانسفکشن هم‌زمان پلاسمید pEGFP-N1 و با تکنیک فلوسایتومتری بازده ترانسفکشن مورد بررسی قرار گرفت. در نهایت بیان و چگونگی استقرار پروتئین core+1 در سلول توسط میکروسکوپ هم‌کانون ارزیابی شد. یافته‌ها: نتایج هضم آنزیمی و تعیین توالی صحت مراحل کلونینگ را نشان داد. آنالیز فلوسایتومتری بازده بالای روش الکتروپوریشن را در مقایسه با لیپوفکشن برای ترانسفکشن سلول‌های Huh7 نشان داد. هم‌چنین بیان پروتئین core+1 در سلول‌های Huh7 با استفاده از آنتی‌بادی anti-His و میکروسکوپ هم‌کانون مورد تائید قرار گرفت. نتیجه گیری: نتایج این پژوهش بیان یوکاریوتی پروتئین core+1 در سلول‌های Huh7 را نشان داد که به این ترتیب می تواند که ابزار مناسبی را برای مطالعه نقش تداخلی پروتئین در مسیرهای سیگنالینگ سلولی و برهم‌کنش آن با سایر پروتئین‌ها در اختیار ما قرار دهد.

المصادر:

1. Demetrious VL, Vijver D, Kostrikis G. Molecular epidemiology of Hepatitis C Infectiom in Cyprus: Evidence of polyphyletic infection. J Med Virol. 2009 (4): 238-248.

2. Chevaliez S, Pawlotasky JM. Hepatitis C Virus serologic and virologic tests and clinical diagnosis of HCV-related liver disease. Int J Med Sci. 2006; 3(2): 35-40.

3. Brass V, Moradpour D, Blum HE., 2006. Molecular virology of hepatitis C virus (HCV). Int J Med. 3(2), 29-34.

4. Guidotti, L. G. and Chisari, F. V. Immunobiology and pathogenesis of viral hepatitis. Annu. Rev. Pathol. 2006 (1): 23–61.

5. Roingeard P, Hourioux C. Hepatitis C virus core protein, lipid droplet and steatosis. J Viral Hepatitis. 2008 (15): 157-164.

6. Branch, A. D., Stump, D. D., Gutierrez, J. A., Eng, F. and Walewski, J. L. The hepatitis C virus alternate reading frame (ARF) and its family of novel products: the alternate reading frame protein/F-protein, the double-frameshift protein, and others. Liver Dis. 2005 (25): 105–117

7. Vassilaki N, Mavromara P. Two alternative translation mechanisms are responsible for the expression of the HCV ARFP/F/Core+1 coding open reading frame. JBC. 2003 (4):03-13.

8. Boulant S, Bwchi M, Penin F, and Lavergne JP. Unusual multiple recoding event leading to alternative form of Hepatitis C virus core protein frome genotype 1b. JBC. 2003 278(4):45785-45792.

9. Brail M, Brakier GL. 2005. Translation of the F protein of hepatitis C virus is initiated at non-AUG codon in a 11 reading frame relative to the polyprotein. Nucleic Acid Res. 2005 (5): 74-86.

10. Basu A, Steele R, Ray R, Ray RB. Functional properties of 16 KDa protein translated from an alternative open reading frame protein of core-encoding genomic region of hepatitis C virus. J Gen virol. 2004  (8): 2299-2306.

11. Branch AD, Walewaski JL, Gutierrez JA. HCV alternative reading frame protein (ARFP) may be virulence factor that help the virus survive adverse conditions. Hepatol.2003 (3): 468A-479A.

12. Branch AD, Walwaski JA, et al. HCV alternative reading frame proteins (ARFP) may be virulence factors that help the virus surive adverse conditions. Hepatol. 2003 (8): 8A-9A.

13. Ratinier M, Boulant S, Crussard S, Maclauchlan J, Lavergne JP. Subcellular localization of the hepatitis C virus alternative reading frame proteins. Virus Res. 2009 (9): 106-110.

14. Roohvand F, Aghasadeghi MR, Sadat SM, Budkowaska A, Khabiri AR. HCV core protein immunization with Montanide/CpG elicits strong Th1/Th2 and long-lived CTL response. BBRC. 2007 (4): 641-649.

15. Canatella PJ, Prausnitz MR. Prediction and optimization of gene transfection and drug delivery by electroporation. Naure Publishing Group. 2001(8): 64-69.

16. Chinnaswamy, S., Yarbrough, I., Palaninathan, S., Kumar, C. T., Vijayaraghavan, V., Demeler, B., Lemon, S. M., Sacchettini, J. C. and Kao, C. C. A locking mechanism regulates RNA synthesis and host protein interaction by the hepatitis C virus polymerase. J. Biol. Chem. 2008 (2): 20535–20546.

17. Mei LT, Chug HC, Chau TY. Interaction of hepatitis C virus F protein with perfoldin 2 perturb tubulin cytoskeleton organization. Biochem Biophys Res Commun. 2006  (1): 271-277.

18. Chang, K. S., Jiang, J., Cai, Z. and Luo, G. Human apolipoprotein e is required for infectivity and production of hepatitis C virus in cell culture. J. Virol. 2007 (1) : 13783–13793.

19. Xu Z, Choi J, Lu W, Ou JH. Hepatitis C virus F protein is short –live protein associated with the endoplasmic reticulum. J Virol. 2003 (2): 1578-1583.