مطالعه درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز بر ویژگی‏های پروتئین هیدرولیز شده ضایعات ماهی کپور نقره ‏ای

الموضوعات : علوم آبزیان

طیبه دهاز ¹ (گروه شیلات، دانشکده منابع طبیعی، دانشگاه تهران، کرج، ایران.)
مهدی زارعی ² (باشگاه پژوهشگران جوان و نخبگان، واحد بوشهر، دانشگاه آزاد اسلامی، بوشهر، ایران)
هدی جاسمیان فرد ³ (گروه فراوری محصولات شیلاتی موسسه آموزش عالی خرد- بوشهر-ایران.)

تاريخ الإرسال : 04 الثلاثاء , محرم, 1444 تاريخ التأكيد : 29 السبت , محرم, 1444 تاريخ الإصدار : 25 الثلاثاء , محرم, 1444

الکلمات المفتاحية: عناصر معدنی, پروتئین هیدرولیز شده, درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز, ضایعات ماهی کپور نقره&rlm, ای,

ملخص المقالة :

هدف از تحقیق حاضر، بررسی درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز بر ویژگی های پروتئین هیدرولیز شده ضایعات ماهی کپور نقره ای (Hypophthalmichthys molitrix) می باشد. برای این منظور، پروتئین های هیدرولیز شده با استفاده از درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز (به ترتیب 5/0، 1، 5/1 و 2 درصد مقدار پروتئین نمونه، آنزیم به ارلن مایر حاوی نمونه ها افزوده شد)تولید شد و آزمایش های اندازه گیری مقدار پروتئین کل، رطوبت، چربی، خاکستر، پروتئین محلول، اندازه گیری درجه هیدرولیز، بازیافت نیتروژنی، مقادیر عناصر معدنی و شاخص های رنگ سنجی (روشنایی، قرمزی و زردی) بر نمونه های تولیدی انجام گرفت. طبق نتایج حاصل، با افزایش درصد آنزیم به سوبسترا مقادیر رطوبت، چربی، بازیافت نیتروژنی و شاخص قرمزی افزایش و مقادیر خاکستر، شاخص روشنایی و زردی دچار کاهش شدند. بطور کلی، با افزایش درصد آنزیم آلکالاز نسبت به سوبسترا، تا یک مقدار مشخص که در این تحقیق 5/1 درصد آنزیم بود، مقدار درجه هیدرولیز افزایش می یابد اما پس از آن، افزایش بیشتر در مقدار آنزیم منجر به کاهش درجه هیدرولیز و اثر منفی بر سایر آزمایش های دیگر شد.

نص كامل:



بررسی درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز بر ویژگی‏های پروتئین هیدرولیز شده ضایعات ماهی کپور نقره‏ای (Hypophthalmichthys molitrix)

 

 

چکیده

هدف از تحقیق حاضر، بررسی درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز بر ویژگی‏های پروتئین هیدرولیز شده ضایعات ماهی کپور نقره‏ای (Hypophthalmichthys molitrix) می‏باشد. برای این منظور، پروتئین‏های هیدرولیز شده با استفاده از درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز (به ترتیب 5/0، 1، 5/1 و 2 درصد مقدار پروتئین نمونه، آنزیم به ارلن‏مایر حاوی نمونه‏ها افزوده شد)تولید شد و آزمایش‏های اندازه‏گیری مقدار پروتئین کل، رطوبت، چربی، خاکستر، پروتئین محلول، اندازه‏گیری درجه هیدرولیز، بازیافت نیتروژنی، مقادیر عناصر معدنی و شاخص‏های رنگ‏سنجی (روشنایی، قرمزی و زردی) بر نمونه‏های تولیدی انجام گرفت. طبق نتایج حاصل، با افزایش درصد آنزیم به سوبسترا مقادیر رطوبت، چربی، بازیافت نیتروژنی و شاخص قرمزی افزایش و مقادیر خاکستر، شاخص روشنایی و زردی دچار کاهش شدند. بطور کلی، با افزایش درصد آنزیم آلکالاز نسبت به سوبسترا، تا یک مقدار مشخص که در این تحقیق 5/1 درصد آنزیم بود، مقدار درجه هیدرولیز افزایش می‏یابد اما پس از آن، افزایش بیشتر در مقدار آنزیم منجر به کاهش درجه هیدرولیز و اثر منفی بر سایر آزمایش‏های دیگر شد.

 

کلمات کلیدی: پروتئین هیدرولیز شده، درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز، عناصر معدنی، ضایعات ماهی کپور نقره‏ای.

مقدمه

امعاء و احشاء ماهیان یکی از مهمترین ضایعات صنعت فراوری محصولات شیلاتی است که منبعی غنی از پروتئین و اسیدهای چرب چندغیراشباعی با قابلیت ماندگاری پایین است. با کاربرد تکنولوژی بازیافت پروتئین از ضایعات ماهی، به نظر می‏رسد امکان تولید طیف گسترده‏ای از ترکیبات غذایی یا محصولات صنعتی برای رنج وسیعی از کاربردها وجود دارد. در این زمینه استفاده از ضایعات ماهیان، مواد خام و همچنین گونه‏های ماهی کم مصرف، مطرح می‏باشد. امعاء و احشاء ماهیان یکی از مهمترین ضایعات صنعت فراوری محصولات شیلاتی است که منبعی غنی از پروتئین و اسیدهای چرب چندغیراشباعی با قابلیت ماندگاری پایین است. تغییرات و تعدیلات آنزیمی پروتئین‏ها با استفاده از آنزیم‏های پروتئولیتیک انتخابی برای شکستن باندهای مخصوصی از پپتیدها بطور گسترده‏ای در صنایع غذایی استفاده می‏شود (چالامیاه¹ و همکاران، 2012).  تغییرات و تعدیلات آنزیمی پروتئین‏ها با استفاده از آنزیم‏های پروتئولیتیک انتخابی برای شکستن باندهای مخصوصی از پپتیدها بطور گسترده‏ای در صنایع غذایی استفاده می‏شود (چالامیاه و همکاران، 2012).

پروتئین هیدرولیز شده ماهیان دارای کاربردهای وسیعی هستند. این مواد به دلیل داشتن پپتیدهای زیست فعال، کندروتین سولفات و خواص ضد اکسایشی، از جمله مواد مناسب برای درمان سرطان می‏باشند. از طرف دیگر به دلیل کوتاه بودن زنجیره پپتیدی، دارای قابلیت هضم بالایی هستند و می‏توانند به عنوان مکمل پروتئینی در تغذیه انسان، دام و آبزیان مورد استفاده قرار بگیرند. همچنین نقش موثر پروتئین هیدرولیز شده به عنوان منبع نیتروژن در محیط‏های کشت باکتریایی به اثبات رسیده است. معمول‏ترین پروتئازهایی که برای هیدرولیز پروتئین ماهی استفاده می‏شوند از منابع گیاهی مانند پاپائین، یا منابع جانوری مانند پپسین، کیموتریپسین و تریپسین می‏باشند. آنزیم‏هایی با منشاء میکروبی نیز برای هیدرولیز پروتئین ماهی استفاده می‏شوند. در مقایسه با آنزیم‏هایی با منشاء گیاهی یا جانوری، آنزیم‏های با منشاء میکروبی دارای مزیت‏هایی از جمله فعالیت کاتالیتیکی با تنوع زیاد، پایداری بالا در دما و pH می‏باشند (اویسی‏پور و همکاران، 2009). بطور کلی، مناسب بودن آنزیم آلکالاز به دلیل اینکه می‏تواند در طی مدت کوتاهی تحت شرایط کنترل شده pH، درجات بالایی از هیدرولیز را ایجاد کند، در مقایسه با آنزیم‏های خنثی یا اسیدی، گزارش شده است (بهاسکار و همکاران، 2008). پروتئین هیدرولیز شده باعث بهبود جذب روده‏ای شده و همچنین به عنوان منبع نیتروژن در فرمولاسیون محیط کشت میکروبی کاربرد دارد (کریستینسون و راسکو، 2000). بنابراین، تحقیق حاضر در جهت بررسی درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز بر ویژگی‏های پروتئین هیدرولیز شده ضایعات ماهی کپور نقره‏ای انجام گردید.

مواد و روش ها

امعاء و احشاء و سر ماهی کپور نقره‏ای به عنوان ماده خام اولیه، بصورت تازه از استخر پرورش ماهی واقع در بوشهر تهیه ‏شد و با یخ‏پوشی مناسب در یونولیت به آزمایشگاه منتقل گردید. پس از پاکسازی و شستشوی، نمونه‏ها بسته‏بندی شده و تا زمان انجام آزمایش در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری شدند. برای انجام آزمایش، نمونه‏ها در دمای 4 درجه سانتیگراد انجمادزدایی گردید.

به منظور آماده‏سازی نمونه‏ها، ابتدا امعاء و احشاء و سر منجمد شده در دمای 4 درجه سانتیگراد انجمادزدایی شده و با استفاده از دستگاه چرخ‏گوشت، چرخ شده و کاملاً یکنواخت و همگن ‏شدند. برای کلیه تیمارها 50 گرم نمونه هموژن شده در ارلن‏مایر 250 میلی‏لیتر ریخته و پس از افزودن بافر فسفات به نسبت 2 به 1 (بافر فسفات به سوبسترا) برای مدت 20 دقیقه درون حمام آبی در دمای 85 درجه سانتیگراد جهت غیر فعال شدن آنزیم‏های داخلی قرار داده ‏شدند (اویسی‏پور و همکاران، 2009). پس از خنک شدن، با استفاده از سود N 2/0 تنظیم pH معادل 5/8 برای آنزیم آلکالاز انجام گردید و به ترتیب 5/0، 1، 5/1 و 2 درصد مقدار پروتئین نمونه، آنزیم به ارلن‏مایر حاوی نمونه‏ها افزوده شد.

ارلن‏مایرهای حاوی نمونه‏های تیمارها، به مدت 2 ساعت در انکوباتور شیکردار با دمای 55 درجه سانتیگراد قرار داده شدند. در پایان، به منظور غیر فعال کردن آنزیم آلکالاز، نمونه‏ها به مدت 10 دقیقه در حمام آبی با دمای 95 درجه سانتیگراد قرار داده شده و پس از آن سرد گردیدند. سپس جهت جداسازی مواد غیر محلول از پروتئین‏های محلول، نمونه‏ها تحت دمای 4 درجه سانتیگراد و به مدت 20 دقیقه با دورrpm 8000 سانتریفیوژ ‏شدند. سوپرناتانت جدا شده از مرحله سانتریفیوژ جمع‏آوری و با استفاده از اسپری‏درایر ‏خشک گردیدند و آزمایشات شیمیایی، اندازه‏گیری غلظت پروتئین محلول، درجه هیدرولیز، بازیافت نیتروژنی، مقدار مواد معدنی و رنگ‏سنجی بروی آنها انجام گردید.

روش تجزیه و تحلیل داده ها

از تیمارهای تولیدی به شکل تصادفی نمونه‏برداری انجام گردید. بررسی نرمال بودن داده‏ها با آزمون كولموگراف_اسميرنوف² انجام شده و نتایج حاصل از آزمایشات شیمیایی با استفاده از آنالیز یک‏طرفه³ با کمک نرم افزار SPSS تجزیه و تحلیل ‏شد. برای مقایسه میانگین داده‏ها از آزمون چند دامنه‏ای دانکن⁴ در سطح احتمال 05/0= α استفاده ‏شد. نمودارهای مربوطه در نرم‏افزار اکسل⁵ رسم گردیدند.

نتایج و بحث

4-1-نتایج حاصل از پروتئین محلول

نتایج میانگین مقدار پروتئین ضایعات ماهی کپور معمولی 11/18 درصد پروتئین بود که از این مقدار پروتئین برای محاسبه میزان آنزیم مورد نیاز جهت فرایند هیدرولیز استفاده گردید. از آنجا که استفاده از آنزیم‏های تجاری جهت تولید پروتئین هیدرولیز شده بسیار معمول شده است، در این تحقیق از درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز برای تولید پروتئین هیدرولیز شده حاصل از ضایعات ماهی کپور نقره‏ای استفاده شد. طبق نتایج حاصله در جدول 4-1، میزان پروتئین محلول در تیمارهای مختلف پروتئین هیدرولیز شده تولیدی اختلاف معنی‏داری به نمایش گذاشت (05/0‏˂‏p). بالاترین میزان پروتئین محلول در تیمارهای تولیدی با استفاده از 1 و 2 درصد آنزیم آلکالاز و کمترین میزان پروتئین محلول در تیمار تولیدی با استفاده از 5/1 درصد آنزیم آلکالاز مشاهده شد (شکل 1). تیمار تولید شده با استفاده از 5/0 درصد آنزیم آلکالاز مقدار پروتئین محلول بالاتر از 5/1 درصد و کمتر از 1 و 2 درصد آنزیم آلکالاز نشان داد.

 

 

 

شکل ۱- مقادیر پروتئین محلول در پروتئین هیدرولیز شده حاصل از ضایعات ماهی کپور نقره‏ای با استفاده از درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز

به نظر می‏رسد کاربرد مقادیر بالاتر آنزیم طی فرایند هیدرولیز منجر به بالا رفتن مقادیر پروتئین در پروتئین هیدرولیز شده تولیدی می‏گردد، اما این نتیجه درباره مقدار 5/1 درصد آنزیم صدق نکرد و پروتئین‏های هیدرولیز شده حاصل از 5/1 درصد آنزیم آلکالاز کمترین مقدار پروتئین را نشان دادند. نتایج مربوط به مقدار پروتئین، حاکی از افزایش بسیار زیاد میزان پروتئین در محصول هیدرولیز شده می‏باشد که می‏تواند به عنوان منبعی از پروتئین‏های ضروری در نظر گرفته شود. مقادیر بالای پروتئین در نتیجه‏ی حلالیت پروتئین طی فرایند هیدرولیز، حذف ترکیبات نامحلول غیرپروتئینی که طی فرایند هیدرولیز هضم نشده‏اند و همچنین حذف جزئی چربی پس از فرایند هیدرولیز نسبت داد (بنجاکول⁶ و موریسی⁷، 1997). مقدار حلالیت پروتئین به میزان چربی موجود در ماده خام اولیه بستگی دارد، بطوریکه مواد خامی که مقادیر بالایی از چربی را دارا باشند، درصد کمتری پروتئین محلول خواهند داشت. به همین دلیل در برخی مطالعات چربی‏زدایی مواد خام اولیه از طریق تیمار این مواد با ایزوپروپانول انجام می‏گردد (تیانسیلاکول و همکاران، 2007). این افزایش مقدار پروتئین در واقع نوعی غنی‏سازی پروتئین به حساب می‏آید. نتایج پژوهش‏های دیگر نیز حاکی از میزان بالای پروتئین در محصولات هیدرولیز شده‏ی پروتئینی می‏باشد (اویسی‏پور و همکاران، 2009؛ کریستینسون و راسکو، 2000).

4-2-نتایج حاصل از درجه هیدرولیز

نتایج حاصل از محاسبه درصد درجه هیدرولیز ، وجود اختلاف معنی‏دار میان تیمارهای مختلف پروتئین هیدرولیز شده حاصل از ضایعات ماهی کپور نقره‏ای با استفاده از درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز را نشان می‏دهد (05/0‏˂‏p) (شکل 2). تیمارهای تولیدی با استفاده از 1 و 2 درصد آنزیم آلکالاز کمترین میزان پروتئین محلول و تیمار تولیدی با استفاده از 5/1 درصد آنزیم آلکالاز بالاترین میزان پروتئین محلول را نشان دادند (شکل 2). تیمار تولید شده با استفاده از 5/0 درصد آنزیم آلکالاز مقدار پروتئین محلول کمتر از 5/1 درصد و بالاتر از 1 و 2 درصد آنزیم آلکالاز نشان داد.

 

شکل 2- مقادیر درصد هیدرولیز در پروتئین هیدرولیز شده حاصل از ضایعات ماهی کپور نقره‏ای با استفاده از درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز

به نظر می‏رسد با افزایش درصد آنزیم آلکالاز نسبت به سوبسترا، تا یک مقدار مشخص که در این تحقیق 5/1 درصد آنزیم بود، در مقایسه با درصد کم آن در نمونه‏های تولیدی از 5/0 درصد آنزیم، مقدار درجه هیدرولیز افزایش می‏یابد اما پس از آن، افزایش بیشتر در مقدار آنزیم منجر به کاهش درجه هیدرولیز شد. در نمونه‏های حاصل از 1 درصد آنزیم ترتیب خاصی در اثر آنزیم بکار رفته نسبت به سوبسترا بر درجه هیدرولیز مشاهده نشد. در تحقیق حاضر نسبت 5/1 درصد آنزیم آلکالاز به عنوان نسبت بهینه بدست آمد. بنابراین با افزایش غلظت سوبسترا، آنزیم اشباع شده و فعالیت آنزیم به سمت حداکثر پیش می‏رود. اما افزایش نسبت آنزیم به سوبسترا بطور همیشگی دلیل بر کارایی بیشتر نمی‏باشد و در یک نقطه یا محدوده بهینه کارایی آنزیم حداکثر خواهد بود. در نتیجه مشخص می‏گردد که افزایش بیشتر آنزیم مصرفی نمی‏تواند منجر به تولید پروتئین با حداکثر درجه هیدرولیز شود. مطالعات دیگر مانند اویسی‏پور و همکاران (2012) بر بهینه‏سازی هیدرولیزی ضایعات ماهی تون نیز ثابت کرد که افزایش میزان آنزیم با افزایش فعالیت آنزیمی همراه است، تا زمانی که به نقطه بهینه برسد، ولی افزایش میزان آنزیم بالاتر از نقطه‏ی بهینه منجر به کاهش میزان فعالیت آنزیم می‏گردد و به موجب آن میزان درجه هیدرولیز کاهش می‏یابد. در مطالعه پاچئو-آگولار و همکاران (2008) با بررسی ویژگی‏های عملکردی پروتئین هیدرولیز شده از گوشت ماهی Merluccius productus شاهد افزایش درجه هیدرولیز و درجه حلالیت پروتئین بودند. درجه هیدرولیز بالا منجر به تولید پپتیدهایی با وزن مولکولی کمتر شده و در نتیجه مقدار حلالیت آن‏ها افزایش پیدا می‏کند.

4-3-نتایج حاصل از رطوبت

میزان رطوبت میان تیمارهای مختلف پروتئین هیدرولیز شده حاصل از ضایعات کپور نقره‏ای با استفاده از درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز وجود اختلاف معنی‏داری میان تیمارها نشان داد (05/0‏˂‏p) (شکل 3). طبق شکل 3 تیمارهای حاصل از 5/0 و 2 درصد آنزیم آلکالاز بالاترین مقدار رطوبت و تیمار حاصل از 1 درصد آنزیم آلکالاز کمترین میزان رطوبت را به نمایش گذاشتند (شکل 3). تیمار پروتئین هیدرولیز شده با استفاده از 5/1 درصد آنزیم آلکالاز مقدار رطوبت بالاتر از تیمار 1 درصد و رطوبت کمتری نسبت به تیمارهای 5/0 و 2 درصد نشان داد.

 

شکل 3- مقادیر رطوبت در پروتئین هیدرولیز شده حاصل از ضایعات ماهی کپور نقره‏ای با استفاده از درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز

اویسی‏پور و همکاران (1389) با بررسی پروتئین هیدرولیز شده از امعاء و احشاء ماهی تون زردباله با استفاده از آنزیم‏های پروتئاز میکروبی آلکالاز، پروتامیکس و فلاورزایم به این نتیجه رسیدند که پروتئین‏های هیدرولیز شده حاصل از آنزیم آلکالاز درجه هیدرولیز بالاتری نسبت به پروتئین‏های هیدرولیز شده حاصل از دو آنزیم دیگر داشت اما هیچ اختلاف معنی‏داری از لحاظ میزان چربی، رطوبت و خاکستر میان نمونه‏های تولیدی وجود نداشت. پاچئو-آگولار و همکاران (2008) نیز با بررسی ویژگی‏های عملکردی پروتئین هیدرولیز شده از گوشت ماهی Merluccius productus بیان نمودند مقادیر رطوبت، پروتئین و خاکستر میان نمونه‏های تولیدی اختلاف معنی‏داری نداشتند. نتایج تحقیق حاضر با نتایج حاصل از تحقیقات اخیر مغایرت داشت بطوریکه در تحقیق حاضر، اختلاف معنی‏دار میان فاکتورهای ترکیبات تقریبی رطوبت، پروتئین و خاکستر مشاهده شد.

4-4-نتایج حاصل از چربی

بررسی نتایج مقدار چربی در تیمارهای مختلف پروتئین هیدرولیز شده حاصل از ضایعات ماهی کپور نقره‏ای ثابت کرد که اختلاف معنی‏داری میان تیمارهای مختلف وجود دارد (05/0‏˂‏p) (شکل ۴). با افزایش درصد آنزیم آلکالاز استفاده شده، مقدار چربی تیمارها روند صعودی را نشان داد، بطوریکه پروتئین هیدرولیز شده حاصل از 5/0 درصد آنزیم آلکالاز کمترین و پروتئین هیدرولیز شده حاصل از 2 درصد آنزیم آلکالاز بیشترین مقدار چربی را نشان دادند (شکل ۴).

 

 

شکل 4- مقادیر چربی در پروتئین هیدرولیز شده حاصل از ضایعات ماهی کپور نقره‏ای با استفاده از درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز

احتمالاً کاربرد مقادیر کمتر آنزیم اثر بهتری بر شکسته شدن پیوندهای پپتیدی پروتئین‏ها داشته است که می‏توان نتیجه حاصل را به آن نسبت داد. همچنین نتایج کاهش قابل توجه چربی را در محصول پروتئین هیدرولیز شده نشان می‏دهد که، این موضوع می‏تواند به دلیل شکسته شدن پیوندهای پپتیدی و سانتریفیوژ نمونه‏ها باشد که باعث می‏شود در طی سانتریفیوژ با دور بالا، چربی به پروتئین‏های نامحلول متصل شده و همراه آن‏ها رسوب کند. نتایج سایر محققین نیز بیانگر مقادیر کم چربی در محصول هیدرولیز شده می‏باشد که برخی از آن‏ها میزان چربی محصول را زیر 1 درصد گزارش کرده‏اند (سلزیت⁸ و همکاران، 2005). پروتئین هیدرولیز شده به طور معمول به عنوان یک فراورده کم‏چرب محسوب می‏گردد که به دلیل ویژگی آنتی‏اکسیدانی می‏تواند سبب جلوگیری یا کاهش اکسیداسیون چربی و پروتئین در ماهی در زمان نگهداری شود (نیکو و همکاران، 2014). در تحقیق حاضر کمترین مقدار چربی 44/10 درصد چربی بود که در تیمار حاصل از 5/0 درصد آنزیم آلکالاز مشاهده شد و سایر تیمارها مقدار چربی نزدیک به ماده خام اولیه (ضایعات ماهی کپور نقره‏ای) دارا بودند. علت این تفاوت را می‏توان در نحوه تولید پروتئین هیدرولیز شده دانست. سلزیت و همکاران (2005) بیان نمودند که زمانی که در فرایند تولید پروتئین هیدرولیز شده از حرارت برای غیرفعال کردن آنزیم‏های داخلی استفاده می‏شود، امولسیون‏های پایداری از چربی و پروتئین شکل می‏گیرند که منجر به افزایش چربی در فراورده نهایی می‏گردند.

4-5-نتایج حاصل از خاکستر

تفاوت آماری میزان خاکستر میان تیمارهای مختلف پروتئین هیدرولیز شده حاصل از ضایعات ماهی کپور نقره‏ای با استفاده از درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز معنی‏دار بود (05/0‏˂‏p) (شکل 5). بالاترین میزان خاکستر در تیمار پروتئین هیدرولیز شده حاصل از 1 درصد آنزیم آلکالاز و کمترین میزان خاکستر در تیمار پروتئین هیدرولیز شده حاصل از 2 درصد آنزیم آلکالاز مشاهده شد (شکل ۵). تیمارهای پروتئین هیدرولیز شده حاصل از 5/0 و 5/1 درصد آنزیم آلکالاز مقادیر متوسطی از میزان خاکستر را در مقایسه با تیمارهای پروتئین هیدرولیز شده حاصل از 1 و 2 درصد آنزیم آلکالاز به نمایش گذاشتند.

 

 

 

شکل ۵- مقادیر خاکستر در پروتئین هیدرولیز شده حاصل از ضایعات ماهی کپور نقره‏ای با استفاده از درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز

همانطور که نتایج نشان دادند، میزان خاکستر در نمونه‏های هیدرولیز شده نسبت به ماده خام اولیه با اختلاف معنی‏داری افزایش یافت. علت این امر می‏تواند به دلیل افزایش میزان ماده خام خشک و نیز کاربرد بافر برای ثابت نگه داشتن pH در طی واکنش باشد. مقادیر بالای خاکستر به عنوان مانعی در کاربرد پروتئین هیدرولیز شده می‏تواند نقش داشته باشد زیرا باعث محدود شدن کاربردهای پروتئین هیدرولیز شده می‏گردد (شهیدی و همکاران، 1995). در مطالعات مختلفی که در خصوص هیدرولیز بافت ماهیان با استفاده از آنزیم‏های پروتئازی انجام گرفته است قید شده که خصوصیات عملکردی و ارزش غذایی پروتئین هیدرولیز شده به عوامل زیادی از جمله نوع ماهی، نوع و مقدار آنزیم مورد استفاده، pH، دما، درجه هیدرولیز و زمان هیدرولیز بستگی دارد (چالامیاه⁹ و همکاران، 2012). علت افزایش میزان خاکستر می‏تواند به دلیل افزایش ماده‏ی خشک و نیز کاربرد اسیدکلریدریک و هیدروکسید سدیم برای تنظیم pH در طی واکنش باشد (مشگین‏فر، 1393). اویسی‏پور و همکاران (1389) نشان دادند که میزان خاکستر در پروتئین هیدرولیز شده امعاء و احشاء ماهی تون زردباله با استفاده از هر سه آنزیم آلکالاز، فلاورزایم و پروتامیکس افزایش داشته است. که نتیجه‏ی تحقیق حاضر را تایید می‏کند. در تحقیق راتاناپورناریسکول¹⁰ و همکاران (2005) میزان خاکستر در پروتئین هیدرولیز شده حاصل از ضایعات سر یک گونه میگو با استفاده از دو آنزیم آلکالاز و فلاورزایم دچار کاهش شد، این نتیجه که با نتیجه تحقیق حاضر مغایرت داشت را می‏توان به دلیل استفاده از ترکیب آب مقطر و بافر فسفات نسبت داد.

4-6-نتایج حاصل از بازیافت نیتروژنی

مقادیر بازیافت نیتروژنی در تیمارهای مختلف پروتئینی هیدرولیز شده حاصل از ضایعات ماهی کپور نقره‏ای با استفاده از درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز در جدول 6 نشان داده شده است. جدول 6 وجود اختلاف معنی‏دار مقدار بازیافت نیتروژنی میان تیمارهای مختلف را به نمایش گذاشت(05/0‏˂‏p). بالاترین میزان بازیافت نیتروژنی در تیمار پروتئین هیدرولیز شده حاصل از 2 درصد آنزیم آلکالاز و کمترین میزان بازیافت نیتروژنی در تیمارهای پروتئین هیدرولیز شده حاصل از 5/0 و 5/1 درصد آنزیم آلکالاز مشاهده شد (شکل 6). تیمار پروتئین هیدرولیز شده حاصل از 1 درصد آنزیم آلکالاز مقدار متوسطی از میزان بازیافت نیتروژنی را در مقایسه با تیمارها به نمایش گذاشت.

 

شکل ۶- مقادیر بازیافت نیتروژنی در پروتئین هیدرولیز شده حاصل از ضایعات ماهی کپور نقره‏ای با استفاده از درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز

نتایج بازیافت نیتروژنی نشان می‏دهد که رابطه مثبتی میان افزایش میزان آنزیم به سوبسترا و مقدار بازیافت نیتروژنی وجود دارد بطوریکه، پروتئین‏های هیدرولیز شده حاصل از 2 درصد آنزیم آلکالاز بالاترین مقدار بازیافت نیتروژنی را نشان دادند. کمترین میزان بازیافت نیتروژنی مربوط به پروتئین‏های هیدرولیز شده حاصل از 5/0 و 5/1 درصد آنزیم آلکالاز بودند و پروتئین‏های هیدرولیز شده حاصل از 1 درصد آنزیم آلکالاز حد وسط مقدار بازیافت نیتروژنی را نشان دادند. به نظر می‏رسد تیمارهای تولید شده با استفاده از 1 درصد آنزیم آلکالاز از این قائده مستثنی بوده و مقدار بازیافت پروتئینی بیشتری نسبت به تیمارهای تولیدی از 5/1 درصد آنزیم آلکالاز نشان دادند. اویسی‏پور و همکاران (1389) طی تحقیقی که بر هیدرولیز آنزیمی پروتئین‏های امعاء و احشاء تاس ماهی ایرانی انجام دادند بیان نمودند که بیشترین میزان بازیافت نیتروژنی مربوط به آنزیم آلکالاز می‏باشد. علت این امر را می‏توان در قدرت و میزان فعالیت پروتئولتیکی بالای آنزیم آلکالاز نسبت داد.

4-7-نتایج حاصل از میزان مواد معدنی

نتایج مقدار مواد معدنی در پروتئین هیدرولیز شده در جدول ‍۱ آورده شده است. طبق نتایج حاصل، با افزایش درصد آنزیم آلکالاز مورد استفاده، مقادیر عناصر معدنی منیزیوم، کلسیم، نیکل، پتاسیم و گوگرد نیز افزایش پیدا کرد، بطوریکه پروتئین‏های هیدرولیز شده حاصل از 5/0 درصد آنزیم آلکالاز کمترین و پروتئین‏های هیدرولیز شده حاصل از 2 درصد آنزیم آلکالاز بیشترین مقادیر این عناصر را نشان دادند. مقادیر آهن، مس، سدیم، پتاسیم، منگنز و کادمیوم در پروتئین‏های هیدرولیز شده بدست آمده از درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز، تغییرات مختلفی نشان دادند.

جدول ۱- مقادیر مواد معدنی موجود در پروتئین هیدرولیز شده حاصل از ضایعات ماهی کپور نقره‏ای با استفاده از درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز

عناصر	5/0 درصد آلکالاز	1 درصد آلکالاز	5/1 درصد آلکالاز	2 درصد آلکالاز
کلسیم Ca	663	830	866	962
کادمیوم Cd	19/0	19/0	18/0	2/0
مس Cu	3	9	6	6
آهن Fe	195	166	186	175
پتاسیم K	7854	9164	9112	8912
منیزیوم Mg	136	478	506	612
منگنز Mn	5˂	5˂	5˂	5˂
سدیم Na	17146	19821	20525	18799
نیکل Ni	4050	6111	6150	6453
فسفر P	4050	6111	6150	6453
گوگرد S	3374	4972	5114	6903

پروتئین هیدرولیز شده حاصل از ضایعات ماهی کپور نقره‏ای با استفاده از درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز دارای ترکیبات مختلفی از مواد معدنی می‏باشد که در جدول 1نشان داده شده است (جدول کامل عناصر معندی تیمارها در قسمت پیوست آورده شده است). سدیم، پتاسیم، کلسیم و منیزیم در سطوح بالایی مشاهده شدند در حالیکه میزان مس و منگنز بسیار پایین بود. مقدار بالای سدیم مربوط به استفاده و کاربرد بافر فسفات برای آماده‏سازی نمونه جهت فرایند هیدرولیز است. مقدار آهن نیز در حد متوسطی بود. این فلزات مشاهده شده می‏توانند به عنوان پرو-اکسیدان در پروتئین هیدرولیز شده عمل کرده و شرایط اکسیداسیون این ترکیب را فراهم نمایند. نقل و انتقال یون‏های فلزی مخصوصاً مس و آهن، یکی از عوامل اصلی کاتالیزروهای فرایند اکسیداسیون می‏باشند (تیانسیلاکول و همکاران، 2007). میزان عناصر منیزیم، کلسیم، نیکل، پتاسیم، فسفر و گوگرد در پروتئین‏های هیدرولیز شده حاصل با افزایش درصد آنزیم آلکالاز مورد استفاده افزایش یافتند اما تغییرات سایر عناصر دیگر در رابطه با افزایش درصد آنزیم آلکالاز از روند خاصی پیروی نکردند. ساتیول¹¹ و همکاران (2003) با بررسی ویژگی‏های عملکردی و بیوشیمیایی ضایعات ماهی هرینگ¹² گزارش نمودند که عناصر پتاسیم، منیزیم، پتاسیم، سدیم، گوگرد و کلسیم در پروتئین هیدرولیز شده شگ ماهیان و ضایعات حاصل از ماهیان فراوان بوده و با توجه به سوبسترای مورد استفاده مقادیر آن‏ها ممکن است متفاوت بوده و تغییر کند. همچنین پروتئین هیدرولیز شده به دلیل نمک‏گذاری جهت نگهداری یا تنظیمات pH در طول تنظیم مقدار pH برای انجام فرایند هیدرولیز، دارای مقادیر متناسبی از NaCl می‏باشند که این مقدار می‏تواند کاربرد پروتئین هیدرولیز شده را محدود نماید (پیکوت¹³ و همکاران، 2006). با بررسی ترکیبات، ویژگی‏های عملکردی و فعالیت آنتی‏اکسیدانی پروتئین هیدرولیز شده ماهی اسکاد¹⁴، تیانسیلاکول و همکاران (2007) بیان نمودند که میزان عناصر سدیم، پتاسیم، کلسیم و منیزیم در پروتئین هیدرولیز شده حاصل در مقادیر بالایی یافت شده در حالیکه عنصر نیکل مشاهده نشد.

4-8-نتایج حاصل از شاخص‏های رنگ‏سنجی

طبق نتایج نشان داده شده در جدول ۲، مقدار شاخص روشنایی در تیمارهای مختلف پروتئینی هیدرولیز شده حاصل از ضایعات ماهی کپور نقره‏ای با استفاده از درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز اختلاف معنی‏داری نشان دادند (05/0‏˂‏p). 

جدول ۲- تجزیه واریانس میزان روشنایی در پروتئین هیدرولیز شده حاصل از ضایعات ماهی کپور نقره‏ای با استفاده از درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز

مقدار روشنایی L*	درجه آزادی	مجموع مربعات	میانگین مربعات	F	Sig
تیمار	3	108/537	179/36	225/82	**00
خطا	8	520/3	440/0
کل	11	057/112

 

نتایج مقدار شاخص قرمزی در تیمارهای مختلف پروتئینی هیدرولیز شده حاصل از ضایعات ماهی کپور نقره‏ای با استفاده از درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز نشان از وجود اختلاف معنی‏دار میان تیمارهای مختلف پروتئین هیدرولیز شده حاصل داشت (05/0‏˂‏p) (جدول ۳).

جدول ۳- تجزیه واریانس میزان قرمزی در پروتئین هیدرولیز شده حاصل از ضایعات ماهی کپور نقره‏ای با استفاده از درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز

مقدار قرمزی a*	درجه آزادی	مجموع مربعات	میانگین مربعات	F	Sig
تیمار	3	853/4	618/1	067/6	*019/0
خطا	8	133/2	267/0
کل	11	987/6

 

جدول ۴ ثابت کرد که شاخص زردی در تیمارهای مختلف پروتئینی هیدرولیز شده حاصل از ضایعات ماهی کپور نقره‏ای با استفاده از درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز اختلاف معنی‏دار به نمایش گذاشت (05/0‏˂‏p).

جدول ۴- تجزیه واریانس میزان زردی در پروتئین هیدرولیز شده حاصل از ضایعات ماهی کپور نقره‏ای با استفاده از درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز

مقدار زردی *b	درجه آزادی	مجموع مربعات	میانگین مربعات	F	Sig
تیمار	3	949/5	983/1	449/6	**016/0
خطا	8	460/2	307/0
کل	11	409/8

 

طبق داده‏های مشاهده شده در جدول ۵، تیمارهای پروتئین هیدرولیز شده حاصل از ضایعات ماهی کپور نقره‏ای با استفاده از 5/0 و 5/1 درصد آنزیم آلکالاز مقدار شاخص روشنایی بالاتری نسبت به تیمارهای حاصل از 1 و 2 درصد آنزیم آلکالاز نشان دادند. مقدار شاخص قرمزی در پروتئین هیدرولیز شده حاصل از 2 درصد آنزیم آلکالاز بالاتر از پروتئین هیدرولیز شده حاصل از 5/0 درصد آنزیم آلکالاز بود و تیمارهای حاصل از 1 و 5/1 درصد آنزیم آلکالاز اختلاف معنی‏داری با تیمارهای حاصل از 5/0 و 2 درصد آنزیم آلکالاز نداشتند (جدول ۵). پروتئین هیدرولیز شده حاصل از 5/0 درصد آنزیم آلکالاز کمترین میزان شاخص زردی را در مقایسه با سایر تیمارها نشان داد و در میان سایر تیمارها اختلاف معنی‏داری مشاهده نشد (جدول 4-11).

جدول ۵-  مقادیر شاخص‏های رنگ‏سنجی در پروتئین هیدرولیز شده حاصل از ضایعات ماهی کپور نقره‏ای با استفاده از درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز

تیمارها	L*	a*	b*
5/0 درصد آنزیم آلکالاز	a4/0±2/81	c0±7/4	b23/0±26/12
1 درصد آنزیم آلکالاز	b13/0±76/74	ab26/0±76/5	a26/0±56/13
5/1 درصد آنزیم آلکالاز	a35/0±13/80	bc26/0±96/4	a26/0±83/13
2 درصد آنزیم آلکالاز	b53/0±63/74	a46/0±3/6	a46/0±1/14

به نظر می‏رسد هر چه درجه هیدرولیز بالاتر باشد میزان شاخص روشنایی نیز بالاتر می‏رود. در مقایسه میزان درجه هیدرولیز با مقدار شاخص روشنایی، پروتئین‏های هیدرولیز شده حاصل از 1 و 2 درصد آنزیم آلکالاز کمترین مقدار درجه هیدرولیز و کمترین میزان روشنایی را نشان دادند. مقادیر شاخص‏های قرمزی و زردی در پروتئین‏های هیدرولیز شده با استفاده از 1، 5/1 و 2 درصد بالاتر از پروتئین‏های هیدرولیز شده با استفاده از 5/0 درصد آنزیم آلکالاز بودند. بر اساس نتایج حاصل می‏توان بیان نمود که افزایش درصدهای آنزیم آلکالاز منجر به افزایش شاخص‏های قرمزی و زردی و کاهش شاخص روشنایی گردید. از طرف دیگر، با افزایش درجه هیدرولیز میزان شاخص روشنایی افزایش و میزان شاخص‏های زردی و قرمزی کاهش یافت که بر خلاف تحقیقات گذشته بود که بیان می‏کردند با افزایش درجه هیدرولیز مقدار شاخص روشنایی و زردی کاهش و مقدار شاخص قرمزی افزایش پیدا می‏کند. دلیل این نتیجه می‏تواند به علت حد بهینه فعالیت آنزیم آلکالاز باشد که با افزایش میزان درصد آنزیم نسبت به سوبسترا دچار تغییر شد. همانطور که در بحث مربوط به درجه هیدرولیز بیان شد، با افزایش غلظت سوبسترا، آنزیم اشباع شده و فعالیت آنزیم به سمت حداکثر پیش می‏رود، اما فعالیت آنزیم در یک نقطه یا محدوده بهینه کارایی خود را خواهد داشت و مشخص می‏گردد که افزایش بیشتر آنزیم مصرفی نمی‏تواند منجر به تولید پروتئین با حداکثر درجه هیدرولیز شود و منجر به تغییرات بیان شده بر شاخص‏های رنگ‏سنجی گردید. بطور کلی، پارامتر روشنایی (L*) با افزایش مدت زمان هیدرولیز کاهش و پارامترهای قرمزی (a*) و زردی (b*) افزایش می‏یابند (دونگ¹⁵ و همکاران، 2008). افزایش زمان هیدرولیز باعث افزایش درجه هیدرولیز شده و به موجب آن واکنش‏های قهوه‏ای شدن و همچنین باعث اکسیداسیون رنگدانه‏ها می‏شود که باعث کاهش میزان روشنایی شده و ظاهر تیره‏ای را ایجاد می‏کند (واسوا و همکاران، 2007). همچنین رنگ تیره پروتئین هیدرولیز شده نتیجه واکنش‏های اکسیداسیون میوگلوبین‏ها و وجود رنگدانه‏های ملانین در ماده خام است و به هر میزان که مقدار میوگلوبین در گوشت بیشتر می‏باشد، رنگ پروتئین هیدرولیز شده تیره‏تر می‏گردد (دونگ و همکاران، 2008).  بنابراین تفاوت موجود در رنگ پروتئین‏های هیدرولیز شده به ترکیب مواد خام اولیه و شرایط فرایند هیدرولیز بستگی دارد.

5-2- نتیجه‏گیری کلی

در مطالعه حاضر اثر درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز بر ویژگی پروتئین‏های هیدرولیز شده حاصل از فرایند هیدرولیز ضایعات ماهی کپور نقره‏ای مورد بررسی قرار گرفت. پروتئین‏های هیدرولیز شده حاصل از 5/1 درصد آنزیم آلکالاز بالاترین میزان درجه هیدرولیز و شاخص روشنایی و زردی و کمترین مقادیر پروتئین محلول، بازیافت نیتروژنی و شاخص قرمزی را نشان دادند. علاوه بر آن، این تیمار حدود متوسط مقادیر رطوبت و خاکستر را دارا بودند. به نظر می‏رسد با افزایش درصد آنزیم آلکالاز نسبت به سوبسترا، تا یک مقدار مشخص که در این تحقیق 5/1 درصد آنزیم بود، مقدار درجه هیدرولیز افزایش می‏یابد اما پس از آن، افزایش بیشتر در مقدار آنزیم منجر به کاهش درجه هیدرولیز و اثر منفی بر سایر آزمایش‏های دیگر شد.

منابع

1.       Benjakul, S., and Morrissey, M.T. 1997. Protein hydrolysates from Pacific whiting solid wastes. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 45: 3423−3430.

2.       Bhaskar, N., Benila, T., Radha, C., and Lalitha, R.G. 2008. Optimization of enzymatic hydrolysis of visceral waste proteins of Catla (Catla catla) for preparing protein hydrolysate using a commercial protease. Journal of Bioresource Technology, 99: 4105- 4111.

3.       Chilamaiah, M., Kumar, B.D., Hemalatha, R., Jyothirmayi, T. 2012. Fish protein hydrolysates: proximate composition, amino acid composition, antioxidant activities and applications: A review. Journal of Food Chemistry, 135: 3020- 3038.

4.       Dong, S., Zeng, M., Wang, D., Liu, Z., Zhao, Y., and Yang, H. 2008. Antioxidant and biochemical properties of protein hydrolysates prepared from silver carp (Hypophthalmichthys molitrix). Journal of food chemistry, 107: 1485-1493.

5.       Kristinsson, H.G., and Rasco, B.A. 2000. Fish protein hydrolysates: Production, biochemical and functional properties. Journal of Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 40: 43–81.

6.       Mehregan Niko, A., Sadeghi Mahonak, A., Ghorbani, M., Taheri, A., and Alami, M. 1392. Optimization of effective factors in the antioxidant activity of hydrolyzed protein of Carassius carassius by response surface methodology. Journal of Food Processing and Preservation, Volume 5, Number 1, 110-95.

7.       Meshginfar, N., Sadeghi Mahonak, A., Ziaeifar, AM, Ghorbani, M., and Kashaninejad, M. 2014. Optimization of hydrolyzed protein production from meat industry by-products by response surface methodology. Journal of Food Industry Research, Volume 24, Number 2, 225-215.

8.       Oveysipour, M., Abedian Kanari, A., Motamedzadegan, A., and Nazari, R.M. 2010. Investigation of properties of hydrolyzed visceral proteins of Thunnus albacares using commercial enzymes. Iranian Journal of Food Science and Technology Research, Volume 6, Number 1, 68-76.

9.       Ovissipour, M., Abedian, A., Motamedzadegan, A., Rasco, B., Safari, R., and Shahiri, H. 2009. The effect of enzymatic hydrolysis time and temperature on the properties of protein hydrolysates from Persian sturgeon (Acipenser persicus) viscera. Journal of Food Chemistry, 115: 238-242.

10.       Ovissipour, M., Rasco, B., Ghorban Shiroodi, S., Modanlow, M., Gholami, S., and Nemati, M. 2012. Anioxidant activity of protein hydrolysates from whole anchovy sprat (Clupeonella engrauliformis) prepared using endogenous enzymes and commercial proteases. Journal of Science and Food Agricultural, 93: 1718- 1726.

11.       Pacheco-Aguilar, R., Angel, M., Manzano, M., and Ramire-Suarez, J.C. 2008. Functiona properties of fish protein hydrolysates from Pacific whiting (Merluccius productus) muscle produced by a commercial protease. Food Chemistry, 109: 782–789

12.       Picot, L., Bordenave, S., Didelot, S., Fruitier-Arnaudin, I., Sannier, F., Thorkelsson, G. 2006. Antiproliferative activity of fish protein hydrolysates on human breast cancer cell lines. Process Biochemistry, 41, 1217–1222.

13.       Ruttanapornvarecsakul, Y., Ikeda, M., Hara, K., Osako, K., Kongpun, O., and Nozaki, Y. 2005. Effect of shrimp head protein hydrolysates on the state of water and denaturation of fish myofibrils during dehydration. Journal of Fisheries Science, 71: 220-228.

14.       Shahidi, F., Han, X.Q., and Synowiecki, J. 1995. Production and characteristics of protein hydrolysates from capelin (Mallotus villosus). Journal of Food Chemistry, 53: 285–293.

15.       Slizyte, R., Dauksas, E., Falch, E., Storro, I., Rustad, T. 2009. Characteristics of protein fractions generated from cod (Gadus morhua) by-products. Journal of Process Biochemistry, 40: 2021–2033.

16.       Thiansilakul, Y., Benjakul, S., and Shahidi, F. 2007. Composition, functional properties and antioxidative activity of protein hydrolysates prepared from round scad (Decapterus maruadsi). Journal of Food Chemistry, 103: 1385-1394.

17.       Vasileva-Tonkova, E., Nustorova, M., and Gushterova, A. 2007. New protein hydrolysates from collagen wastes used as peptone for bacterial growth. Journal of Current Microbiology, 54: 54-57.

18.       Wu, H.C., Chen, H.M., Shiau, C.Y. 2003. Free amino acids and peptides as related to antioxidant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus). Journal of Food Research International, 36: 949- 957.

 

Effects of different percentage of alcalase enzyme on the fish protein hydrolysate properties from silver carp (Hypophthalmichthys molitrix) viscera

Abstract:

The aim of this study was to investigate the characteristics of the protein hydrolyzate from silver carp (Hypophthalmichthys molitrix) viscera using different percentages of Alcalase. For this purpose, hydrolyzed proteins were produced using different percentages of Alcalase and the samples were analyzed for the amount of total protein, moisture, fat, ash, soluble protein, hydrolisis degree, nitrogen recovery, amounts of minerals and color parameters (brightness, redness and yellowness). According to the results, increased the amounts of percentage of enzyme to substrate led to increase the amounts of moisture, fat, nitrogen recovery and red index and decrease the amounts of ash, brightness and yellowness index. In general, by increasing the percentage of Alcalase to the substrate, to a specified amount, that in this study was 1.5 percent, the degree of hydrolysis increased, but then, a further increase in the amount of the enzyme led to reduce the degree of hydrolysis and had negative effects on the other experiments.

 

Key words: Fish protein hydrolysate, Different percentage of Alcalase, Amounts of mineral, Silver carp viscera.

        

1

 

---

[1]  - Chalamaiah

[2] - Kolomogorav – Smirnov 

[3] - One-way ANOVA 

[4] - Dancan's test

[5] - Excel 

[6]  - Benjakul

[7]  - Morrissey

[8]  - Slizyte

[9]  - Chalamaiah

[10]  - Ruttanapornvareesakul

[11]  - Sathivel

[12]  - Clupea harengus

[13]  - Picot

[14]  - Decapterus maruadsi

[15]  - Dong

---