بررسی اثر داروی گیاهی تیماسین‌پلاس®بر عفونت تجربی خوراکی سالمونلا تیفی موریوم در جوجه‌های گوشتی

الموضوعات :

زهرا داودی ¹ , حمید استاجی ² , سحر غفاری خلیق ³ , سیدحسام‌الدین عمادی‌چاشمی ⁴

1 - گروه زیست فناوری میکروبی، دانشکده دانشکده فناوری‌های نوین، دانشگاه سمنان، سمنان
2 - گروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه سمنان
3 - گروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی دانشگاه سمنان، سمنان، ایران
4 - گروه علوم درمانگاهی، دانشکده دامپزشکی دانشگاه سمنان، سمنان، ایران

تاريخ الإرسال : 30 الثلاثاء , ذو الحجة, 1444 تاريخ التأكيد : 25 الخميس , ربيع الثاني, 1445 تاريخ الإصدار : 19 الأربعاء , رجب, 1445

الکلمات المفتاحية: سالمونلا تیفی‌موریوم, Real-time PCR, ختمی, آویشن باغی, شربت تیماسین‌پلاس®, ,

ملخص المقالة :

سالمونلا تیفی‌موریوم یکی از مهمترین و بیماریزاترین سالمونلا‌ها بوده که منجر به آلودگی در انسان، دام و طیور می‌شوند و کاهش تولید و متعاقباً خسارات اقتصادی فراوانی در صنعت طیور به همراه دارد. استفاده از آنتی‌بیوتیک‌ها در جهت کاهش عوارض و از بین بردن باکتری‌ها در دوز‌های مختلف، منجر به ایجاد مقاومت می‌شود. در گیاهان، خاصیت ضدمیکروبی، بطور ذاتی در عناصر سازنده وجود دارد، بنابراین در بدن انباشته نشده و اثرات جانبی آنتی‌بیوتیک‌ها، نظیرمقاومت آنتی‌بیوتیکی، واکنش آلرژیک، مشکلات معده و... به بار نمی‌آورند. پژوهش حاضر به منظور بررسی اثر ضدمیکروبی داروی گیاهی تیماسین‌پلاس® و اثر هم‌افزایی این دارو با آنتی‌بیوتیک اریترومایسین بر عفونت سالمونلا تیفی‌موریوم در جوجه‌های گوشتی یک روزه نژاد رأس 308، انجام گرفت. بدین منظور از 40 قطعه جوجه یک روزه نژاد رأس 308 در چهار گروه ده‌تایی، استفاده گردید. مقدار 2 میلی‌لیتر از سوسپانسیون حاوی CFU 106 باکتری سالمونلا تیفی‌موریوم با سوند معدی به روش گاواژ چینه‌دان به تمام جوجه‌ها، به طور تجربی القاء شد. تیمارهای آزمایشی شامل کنترل منفی (القای عفونت ولی بدون مداخلات درمانی)، درمان با اریترومایسین، درمان با تیماسین‌پلاس® (حاوی عصاره آویشن‌باغی (Thymus vulgaris) و ختمی (Althea officinalis)) و درمان با ترکیب اریترومایسین و تیماسین‌پلاس®، بود. درمان از 24 ساعت پس از القای عفونت آغاز و تا یک روز قبل از نمونه‌گیری ادامه داشت. در روز‌های چهار و دوازده، بعد از مرگ با ترحم، بافت کبد و طحال جداسازی و برای بررسی‌های میکروبی شامل شمارش کلونی و تست Real-time PCR و آسیب‌های بافتی، مورد آزمایش، قرار گرفت. نتایج حاصل از تست Real-time PCR و شمارش کلونی ثابت کرد، شربت تیماسین‌پلاس® دارای اثر ضدمیکروبی بر روی باکتری سالمونلا تیفی‌موریوم است. در این بررسی بیشترین میزان باکتری مختص گروه کنترل و کمترین مقدار مربوط به گروه درمان با اریترومایسین و تیماسین‌پلاس®، بود؛ همچنین در مطالعه نتایج هیستوپاتولوژی بافت کبد و طحال، اختلاف معنی‌داری میان گروه کنترل با سایر گروه‌ها مشاهده شد. طبق یافته‌های این پژوهش مشخص شد، داروی‌گیاهی‌ تیماسین‌پلاس عملکردی مشابه با اریترومایسین دارد و به‌صورت هم‌افزایی با اریترومایسین در کاهش جمعیت باکتری سالمونلا‌تیفی‌موریوم موثر می‌باشد. با توجه به پدیده مقاومت آنتی‌بیوتیکی، بهتر است به جای استفاده از مواد شیمیایی، از داروهای گیاهی و یا ترکیب داروی گیاهی و آنتی‌بیوتیک، استفاده شود.

نص كامل:



بررسی اثر داروی گیاهی تيماسين‌پلاس®بر عفونت تجربی خوراکی سالمونلا تیفی موریوم در جوجه‌های گوشتی

زهرا داودی1، حمید استاجی*2، سحر غفاری‌خلیق3، سیدحسام‌الدین عمادی‌چاشمی4

1- دانش‌آموخته کارشناسی ارشد گروه زیست فناوری میکروبی، دانشکده دانشکده فناوری‌های نوین، دانشگاه سمنان، سمنان، ایران    

2- دانشیارگروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه سمنان، سمنان، ایران

3- استادیار گروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی دانشگاه سمنان، سمنان، ایران 

4- استادیار گروه علوم درمانگاهی، دانشکده دامپزشکی دانشگاه سمنان، سمنان، ایران 

 

 

چکیده

سالمونلا تیفی‌موریوم یکی از مهمترین و بیماریزاترین سالمونلا‌ها بوده که منجر به آلودگی در انسان، دام و طیور می‌شوند و کاهش تولید و متعاقباً خسارات اقتصادی فراوانی در صنعت طیور به همراه دارد. استفاده از آنتی‌بیوتیک‌ها در جهت کاهش عوارض و از بین بردن باکتری‌ها در دوز‌های مختلف، منجر به ایجاد مقاومت می‌شود. در گیاهان، خاصیت ضدمیکروبی، بطور ذاتی در عناصر سازنده وجود دارد، بنابراین در بدن انباشته نشده و اثرات جانبی آنتی‌بیوتیک‌ها، نظیرمقاومت آنتی‌بیوتیکی، واکنش آلرژیک، مشکلات معده و... به بار نمی‌آورند. پژوهش حاضر به منظور بررسی اثر ضدمیکروبی داروی گیاهی تيماسين‌پلاس® و اثر هم‌افزایی این دارو با آنتی‌بیوتیک اریترومایسین بر عفونت سالمونلا تیفی‌موریوم در جوجه‌های گوشتی یک روزه نژاد رأس 308، انجام گرفت. بدین منظور از 40 قطعه جوجه یک روزه نژاد رأس 308 در چهار گروه ده‌تایی، استفاده گردید. مقدار 2 میلی‌لیتر از سوسپانسیون حاوی CFU 106 باکتری سالمونلا تیفی‌موریوم با سوند معدی به روش گاواژ چینه‌دان به تمام جوجه‌ها، به طور تجربی القاء شد. تیمارهای آزمایشی شامل کنترل منفی (القای عفونت ولی بدون مداخلات درمانی)، درمان با اریترومایسین، درمان با تیماسین‌پلاس® (حاوی عصاره آویشن‌باغی (Thymus vulgaris) و ختمی (Althea officinalis)) و درمان با ترکیب اریترومایسین و تیماسین‌پلاس®، بود. درمان از 24 ساعت پس از القای عفونت آغاز و تا یک روز قبل از نمونه‌گیری ادامه داشت. در روز‌های چهار و دوازده، بعد از مرگ با ترحم، بافت کبد و طحال جداسازی و برای بررسی‌های میکروبی شامل شمارش کلونی و تست Real-time PCR و آسیب‌های بافتی، مورد آزمایش، قرار گرفت. نتایج حاصل از تست Real-time PCR و شمارش کلونی ثابت کرد، شربت تیماسین‌پلاس® دارای اثر ضدمیکروبی بر روی باکتری سالمونلا تیفی‌موریوم است. در این بررسی بیشترین میزان باکتری مختص گروه کنترل و کمترین مقدار مربوط به گروه درمان با اریترومایسین و تیماسین‌پلاس®، بود؛ همچنین در مطالعه نتایج هیستوپاتولوژی بافت کبد و طحال، اختلاف معنی‌داری میان گروه کنترل با سایر گروه‌ها مشاهده شد. طبق یافته‌های این پژوهش مشخص شد، داروی‌گیاهی‌ تیماسین‌پلاس عملکردی مشابه با اریترومایسین دارد و به‌صورت هم‌افزایی با اریترومایسین در کاهش جمعیت باکتری سالمونلا‌تیفی‌موریوم موثر می‌باشد. با توجه به پدیده مقاومت آنتی‌بیوتیکی، بهتر است به جای استفاده از مواد شیمیایی، از داروهای گیاهی و یا ترکیب داروی گیاهی و آنتی‌بیوتیک، استفاده شود.

کلمات کلیدی: سالمونلا تیفی‌موریوم، شربت تیماسین‌پلاس®، Real-time PCR، آویشن باغی، ختمی.

چکیده تصویری

 

 

*نویسنده مسئول: حمید استاجی

آدرس: گروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه سمنان، سمنان، ایران.

پست الکترونیک: [e-mail]

 

 

 

مقدمه

به بیماری‌ها و عفونت‌هایی که به طور طبیعی بین مهره‌داران درحال انتقال است، زئونوز می‌گویند. از دلایل اهمیت توجه به زئونوزها می‌توان به علل مرگ و میر در انسان و حیوانات و ایجاد خسارات اقتصادی قابل توجه در صورت وخامت شرایط، اشاره کرد (1). سالمونلا تیفی‌موریوم میکروارگانیسم درون سلولی اختیاری با باسیل‌های گرم منفی، ‌فاقد‌ اسپور در اندازه بین 2 تا 5 میکرومتر و قطر 7/0 تا 5/2 میکرومتر ‌به صورت منفرد، ‌زنجیره‌ی‌ دوتایی‌ و‌ یا ‌چندتایی که قادر به تولید سولفید هیدروژن است و منجر به بیماری‌زایی یا کلونیزه در انسان و حیوانات می‌شود (2,3). اعضای این جنس، معمولاً از راه دهان وارد دستگاه گوارش می‌شود. علائم عمومی این عفونت شامل اسهال، استفراغ، دل‌درد و تب می‌باشد که نهایتا 3 تا 5 بعد از ورود به بدن، ظاهر می‌شود. سروتیپ تهاجمی غیرتیفوئیدی سالمونلا به اصطلاح iNTS (invasive Non-Typhoidal Salmonella) می‌باشد (4,5). بدن برای مقابله با سالمونلا و کاهش عوارض درگیری، به پاسخ ایمنی همورال و سلولی نیاز دارد. عفونت‌زایی سالمونلا، با اتصال پیلی باکتری به سلول‌های انتروسیت (سلول‌های M لایه اپی‌تلیال) روده آغاز می‌شود. به محض رسیدن میکروارگانیسم به سطح اپی‌تلیوم، پرز‌های حاشیه مسواکی روده (Brush border) تخریب شده و بعد از آزاد شدن باکتری به درون سلول، توسط فرورفتگی غشاهای سیتوپلاسمی در برگرفته می‌شوند (اندوسیتوز) و به لامینا پروپریا می‌رسند و به دیگر نقاط بدن منتشر می‌شوند (6,7). 

میزان دز عفونی در گونه‌های سالمونلا با یکدیگر متفاوت است. برای ایجاد عفونت سالمونلایی باید میزان باکتری به گونه‌ای باشد که بتواند بر اسیدیته معده غلبه کرده و در رقابت با فلور طبیعی روده پیروز شود. به طور کلی، حدود CFU 106 باکتری برای ایجاد عفونت ضروری است. در شرایط خاص مثلا کاهش اسیدیته معده، افزایش سن و یا استفاده از آنتی‌اسیدها، میزان این دوز به 103 کاهش می‌یابد (8). بیماری‌زایی سالمونلا در طیور؛ به نژاد، سن، قدرت تهاجمی و توانایی باکتری در زنده ماندن در برابر ایمنی ذاتی و تکثیر داخل سلول بستگی دارد. اندام‌های درگیر در عفونت سالمونلایی شامل ریه‌ها، میوکارد، پریکارد، تخمدان، مجرای تخم‌بر، سنگدان و کیسه زرده می‌باشد (9,10). علائم جوجه‌های درگیر با سالمونلا تیفی‌موریوم، شامل: کندی رشد، بی‌حالی و خواب‌آلودگی، بال و پرهای آشفته و آویزان، تاج رنگ پریده و چروکیده، ضایعه‌های گچی اطراف مخرج، آسیب‌های چشمی، خس خس سینه، کاهش قابلیت باروری و تخم‌گذاری، اسهال و دهیدراسیون می‌باشد  (11,12). 

استفاده نادرست از آنتی‌بیوتیک‌ها، از جمله استفاده از آنها در سیستم‌های تولید دام به عنوان محرک رشد و استفاده بیش از حد از آنها در درمان‌های بالینی، به یک نگرانی بزرگ تبدیل شده است. بعد از شیوع یک بیماری در جامعه، به منظور کاهش عوارض و از بین بردن باکتری‌، از طیف گسترده‌ای از آنتی‌بیوتیک‌ها در دز‌های مختلف استفاده می‌شود؛ این اقدام به مرور زمان، تغییراتی در ساختار ژنتیکی باکتری به وجود می‌آورد که منجر به بروز مقاومت در برابر آنتی‌بیوتیک می‌شود. این اتفاق، قابل انتقال به نسل‌های بعد می‌باشد زیرا بسیاری از سالمونلاهای مقاوم به آنتی‌بیوتیک از طریق مصرف مواد غذایی آلوده با منشاء حیوانی وارد بدن انسان‌ها می‌شود و به خطر انداختن سلامت عمومی و افزایش هزینه‌های مراقبت‌های بهداشتی را به همراه دارند. مقاومت گسترده گونه‌های مختلف باکتری‌ها به آنتی‌بیوتیک‌ها به عامل مرگ و میر صدها هزار نفر در سال مبدل شده است. افزایش مداوم تعداد باکتری‌های مقاوم به آنتی‌بیوتیک‌های رایج و سرعت انتشار ژن‌های مقاومت آنتی‌بیوتیکی در سرتاسر جهان، این نگرانی را تایید می کند (12،13). دانشمندان پیش‌بینی کرده‌اند که پاتوژن‌های مقاوم آنتی‌بیوتیک‌ها تا سال 2050 مسئول 10 میلیون مرگ در سراسر جهان خواهند بود (14). به تازگی سویه‌های خاصی از باکتری‌های مقاوم به بتالاکتامازها و یا AmpC بتالاکتامازها از محصولات غذایی حیوانی جدا و شناسایی شده‌اند. علاوه بر این طیف گسترده‌ای از مقاومت در برابر داروهای ضدمیکروبی مانند سفالوسپورین‌های نسل سوم و چهارم، کارباپنم‌ها، گلیکوپپتیدها و تیگسایکلین، باعث استفاده محدود از این داروها در پزشکی و دامپزشکی شده است. به همین دلیل مقاومت آنتی‌بیوتیکی در سویه‌های سالمونلا و کلون‌های بدخیم می‌توانند درمان عفونت و کنترل بیماری در انسان را دشوار کند و یک خطر جدی برای سلامت عمومی جهانی باشد (15،16). بنابراین سازمان بهداشت جهانی عنوان کرد، سالمونلا یک پاتوژن الویت‌دار است و هدف اصلی ترویج تحقیق و توسعه آنتی‌بیوتیک‌های جدید و یا جایگزینی روش یا ماده جدید بجای آنتی‌بیوتیک برای درمان آن است (17،18)

با توجه به عوارض و سمیت بی‌شمار داروهای شیمیایی، هزینه‌های بالای سنتز و خرید، تمایل به جایگزینی و استفاده از داروهای گیاهی، روز به روز گسترش پیدا می‌کند و از آنجایی که خاصیت ضدمیکروبی و آنتی‌اکسیدانی، موجود در عناصر سازنده، در داروهای گیاهی به صورت ذاتی می‌باشد، این مواد با یکدیگر در تعادل بیولوژیك هستند بنابراین در بدن انباشته نشده و اثرات جانبی خاصی به بار نمی‌آورند (19). شربت تیماسین‌پلاس®، ساخت شرکت مدین فارما، برای تسکین سرفه، درمان برونشیت، خلط آور و برطرف کننده التهاب مجاری تنفسی، استفاده می‌شود. در هر 5 میلی‌لیتر از این شربت، مقدار 400 میلی‌گرم عصاره آویشن باغی (Thymus vulgaris) و 276 میلی‌گرم عصاره ختمی (Althea officinalis) وجود دارد. تیمول و کارواکرول دو جز اصلی موجود در آویشن با اثر هم افزایی و ایجاد کمپلکس با پروتئین‌های غشاء باکتری، فعالیت ضد باکتری خود را اعمال کرده (20) همچنین کارواکرول، قادر به مهار تجمع پلاکتی و تعدیل مسیرهای سیگنالینگ در درگیری‌های التهابی و پرولیفراسیون سلولی می‌باشد (21)، خواص عصاره آویشن در کنار اثرات محافظتی و پانسمان کننده عصاره ریشه ختمی (22) و درمان بیماری‌های معده و روده با وجود منابع مهم موسیلاژ، موجود در انتهای ریشه ختمی (23)، مانع از تبدیل التهاب به یک عفونت باکتریال می‌شود.

هدف از این مطالعه، استفاده از یک داروی گیاهی تجاری برای درمان عفونت سالمونلا تیفی‌موریوم موجود در جوجه‌های گوشتی آلوده، است. از این شربت به طور معمول برای درمان سرفه و استفاده می‌شود ولی با مطالعه خاصیت ضدمیکروبی دو جز سازنده این شربت (آویشن باغی و ختمی)، از بین بردن عفونت سالمونلایی دور از انتظار نیست. 

مواد و روش کار

در این پژوهش، از 40 قطعه جوجه گوشتی یک روزه رأس 308، مخلوط از هر دو جنس با وزن تقریبی 100 گرم، در قالب طرح کاملاً تصادفی، در چهار گروه، استفاده گردید. چهار تیمار آزمایشی شامل کنترل منفی (القای عفونت ولی بدون مداخله دارویی)، درمان با آنتی‌بیوتیک اریترومایسین با دوز 20 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن جوجه، درمان با شربت تیماسین‌پلاس® با دوز 50 میکرو‌لیتر و درمان با آنتی‌بیوتیک اریترومایسین و شربت تیماسین‌پلاس®، بود (24,25). درمان در این گروه‌ها از یک روز بعد از القای عفونت شروع و تا یک روز قبل از نمونه‌برداری ادامه داشت. مقدار 2 میلی‌لیتر از سوسپانسیون حاوی CFU 106 باکتری سالمونلا تیفی‌موریوم (ATCC14028)، با روش گاواژ چینه‌دان (توسط سوند معدی)، در دهان تمام جوجه‌ها تلقیح گردید (26). در طول دوره، حرارت و رطوبت محل نگهداری جوجه‌ها، به ترتیب برابر با 2±32 درجه سانتی‌گراد و %5±60 بود. جوجه‌ها طی این مدت با استفاده از پلت استاندارد (پری‌استاتر و استاتر) تغذیه شدند؛ آب نیز بدون محدودیت خاصی در اختیار آن‌ها قرار داده شد (27). در روز‌های پنجم و سیزدهم پس از القای باکتری، نمونه‌گیری انجام گرفت و پس از مرگ با ترحم، بافت کبد و طحال جدا و به ظرف‌های نمونه‌گیری انتقال داده شد. جهت تعیین بار میکروبی موجود در دو بافت کبد و طحال، از آزمون Real-time PCR و تست‌های میکروبیولوژی و هم‌چنین برای بررسی میزان آسیب سالمونلا تیفی‌موریوم در بافت‌ها، از روش‌های هیستوپاتولوژی استفاده گردید.

ارزیابی تأیید حضور باکتری با کالبدگشایی

بعد از نمونه‌گیری، ارگان‌های داخلی جوجه‌ها از نظر تأیید حضور باکتری سالمونلا تیفی‌موریوم، مورد بررسی کالبد گشایی قرار گرفت و پدیده‌هایی مانند، التهاب و عدم جذب کیسه زرده، مدفوع گچی، تورم و پرخونی کبد و طحال، مشاهده شد (28).

آزمون Real-time PCR

Real-time PCR، روشی استاندارد برای شناسایی و تشخیص میکروارگانیسم‌ها و نشانگرهای خاص ژنتیکی، در انواع مختلف نمونه‌ها بکار می‌رود. حساسیت، سرعت بالا و تکرارپذیری، از مزایا این روش تشخیصی می‌باشد؛ بدین منظور برای شمارش کمی سالمونلا تیفی‌موریوم در بافت کبد و طحال در تیمارهای آزمایشی، از این روش استفاده گردید. برای این تست، ابتدا میزان یکسان (1گرم) از بافت کبد و طحال همه گروه‌های برداشته و بعد از تهیه عصاره سلولی، DNA موجود در بافت‌ها به روش فنول کلروفرم ایزو آمیل الکل، استخراج گردید. سپس در میکروتیوپ‌های 2/0 میلی‌لیتری، میزان 10 میکرولیتر از مخلوط PCR (PCR master mix) شرکت سیناکلون، 1 میکرولیتر از هر یک از پرایمر‌های Forward (GCCAACCATTGCTAAATTGGCGCA) و Reverse (GGTAGAAATTCCCAGCGGGTACTGG) مرتبط با DNA سالمونلا تیفی‌موریوم (3)، 5 میکرولیتر DNA استخراج شده از هر نمونه و 3 میکرولیتر آب مقطر دیونیزه استریل شده، جمعاً به میزان 20 میکرولیتر، ریخته شد (29,30). برای تهیه نمونه کنترل مثبت، از نیم مک‌فارلند، رقت 1/0 تهیه و S1 نامیده شد سپس با رقت سازی سریالی تا 5-10، 5 استاندارد به نام‌های (S1، S2، S3، S4 و S5) به وجود آمد. به جای نمونه کنترل منفی از آب مقطر استفاده و تمامی نمونه‌ها در دستگاه از قبل تنظیم شده، قرار داده شد (31,32).  

سیکل‌های آستانه به صورت نمودار خطی و منحنی توسط دستگاه Real-time PCR رسم شد و اعدادی بر حسب  حد آستانه (Cycle Threshold (CT)) به‌دست آمد و با استفاده از روش Oneway Anova، مورد آنالیز آماری قرار گرفت و داده‌ها در قالب گراف بیان شدند.

تست‌های میکروبیولوژی و شمارش کلونی 

مقدار 1 گرم از بافت کبد و طحال جوجه‌های گوشتی مورد مطالعه، جداسازی و به همراه 1 سی‌سی محلول پپتون‌واتر، درون هاون ریخته شد و کاملاً مخلوط گردید. سوسپانسیون به دست آمده را به یک لوله آزمایش با 9 سی‌سی پپتون‌واتر انتقال و رقت  1-10 ساخته شد. سپس به صورت سریال دایلوشن تا رقت 3-10 این کار ادامه پیدا کرد. برای کشت باکتری  میزان 100 لاندا از هر سه رقت با 5 بار تکرار برداشته و به محیط کشت  SSآگار (Salmonella Shigella Agar) و بلاد آگار (Blood Agar) اضافه و کشت سطحی داده شد. پلیت‌های بلاد آگار به مدت 24 ساعت با دمای 37 درجه سانتی‌گراد و پلیت‌های SS آگار به مدت 48 ساعت با دمای 37 درجه سانتی‌گراد، درون انکوباتور قرار گرفت و سپس شمارش کلونی انجام شد (33,34).

بررسی هیستوپاتولوژی

مکعب‌هایی یکسانی با اندازه حدودی 1 سانتی‌متر مکعب، از بافت کبد و طحال نمونه‌ها، به صورت جداگانه کد گزاری شدند و در ظرف‌های حاوی 60 میلی‌لیتر محلول فرمالین 10 درصد نگهداری شدند و بعد از گذشت 24 ساعت، فرمالین قدیم با جدید تعویض شد و تمام پروسه آبگیری با الکل، شفاف سازی به کمک گزیلل، آغشته سازی با پارافین، کد گذاری نمونه‌ها، قالب زنی، برش و رنگ‌آمیزی با رنگ‌ هماتوکسیلین ائوزین (Haematoxylin and Eosin)، طبق پروتکل انجام گرفت (35). 

برای بررسی نتایج هیستوپاتولوژی، روش درجه بندی انتخاب شد. لام‌های تهیه شده از بافت‌ طحال از نظر رسوب آهن (Hemosiderosis) و تخلیه لنفاوی (Lymphatic Drainage) و لام‌های بافت کبد از نظر نکروز (Necrosis) و التهاب (Inflammation)، به طور کاملاً تصادفی با عدسی‌های 4، 10 و40 مورد بررسی قرار گرفت. سپس هر لام در چهار شان میکروبی با درشت نمایی 400X  یا لنز 40، مشاهده و هر عارضه به‌صورت جداگانه در لام‌ها، برحسب میزان آسیب درجه‌بندی شدند، به این صورت که که اگر در هیچ شان عارضه‌ای دیده نشد، درجه آن 0 می‌شود، اگر در یک شان عارضه دیده شد درجه آن 1، در دو شان عارضه دیده شد درجه آن 2، اگر در 3 شان عارضه دیده شد درجه آن 3  و اگر در 4 شان عارضه دیده شد درجه آن 4 می‌‎شود (24). نتایج مربوط به تست‌های انجام گرفته با نرم افزار One-way ANOVA ، با اختلاف معیار (Pvalue) 05/0 (05/0P<) مورد بررسی آماری قرار گرفت.

نتایج

نتایج آزمون Real-time PCR

برای تفسیر نتایج حاصل از آزمون Real-time PCR به میزان چرخه‌های آستانه ((Ct توجه می‌کنیم، به این صورت که، هرچه میزان چرخه‌های آستانه کمتر باشد یعنی میزان تکثیر و بیان باکتری بیشتر بوده است و در مقابل هرچه میزان چرخه آستانه بیشتر باشد، میزان تکثیر و بیان باکتری کمتر بوده است به عبارت دیگر، در گروه‌هایی که میزان باکتری کمتر باشد، شاهد مقدار چرخه آستانه بالاتری هستیم. ب در این پژوهش، کمترین میزان چرخه آستانه  به گروه‌های ترکیب آنتی‌بیوتیک اریترومایسین و شربت تیماسین‌پلاس® اختصاص داشت (تصویر1). 

 

تصویر1. نمودار میزان چرخه‌های آستانه در گروه‌های مورد مطالعه در نمونه‌گیری اول و دوم. محور عمودی، میزان عدد چرخه‌های آستانه و محور افقی، نام گروه‌های مورد بررسی.

نمودار استاندارد (Standard curve) نشانگر غلظت DNA تکثیر شده، در چرخه‌های آستانه مختلف است (تصویر2).

 

تصویر2. نمودار استاندارد بیانگر میزان غلظت باکتری برحسب چرخه‌های آستانه. محور عمودی میزان عدد چرخه‌های آستانه و محور افقی غلظت باکتری.

 

 

 

 

نتایج تست میکروبی

باکتری‌های رشد یافته در دو محیط SS آگار و بلاد آگار در غلظت 1-10 با روش کلونی کانت، شمارش شد. نتایج به دست آمده نشان داد، در هر دو محیط کشت، میزان باکتری در گروه کنترل از سایر گروه‌ها بیشتر و بعد از آن به ترتیب گروه شربت تیماسین‌پلاس® و آنتی‌بیوتیک اریترومایسین قرار داشت. کمترین میزان باکتری مشاهده شده مربوط به گروه، ترکیب شربت تیماسین‌پلاس® و آنتی‌بیوتیک اریترومایسین بود. هم‌چنین در تمام گروه‌های مورد مطالعه، میزان باکتری در بافت طحال نسبت به کبد بیشتر بود (تصویر 4و3).

 

 

تصویر3. نمودار میزان باکتری رشد یافته در محیط کشت SS آگار در نمونه‌گیری اول و دوم. محور عمودی میزان باکتری و محور افقی نام‌ گروه‌های مورد مطالعه.

 

تصویر4. نمودار میزان باکتری رشد یافته در محیط کشت بلاد آگار در نمونه‌گیری اول و دوم. محور عمودی میزان باکتری و محور افقی نام‌ گروه‌های مورد مطالعه.

نتایج بررسی هیستوپاتولوژی

 آسیب‌های بافتی وارد شده به نمونه‌های مورد مطالعه، شامل تخلیه بافتی طحال (تصویر5)، هموسیدروز طحال (تصویر6)، نکروز کبد (تصویر7) و التهاب کبد (تصویر8) در دو نمونه‌گیری اول و دوم با یکدیگر مقایسه شدند و نتایج حاصل از این بررسی نشان داد بیشترین میزان آسیب‌بافتی وارد شده، مربوط به گروه کنترل در هر دو نمونه‌گیری می‌باشد و اختلاف معنی‌داری بین این گروه با سایر گروه‌ها وجود دارد. در گروه درمان با ترکیب اریترومایسین و شربت تیماسین‌پلاس کمترین میزان آسیب مشاهده شد ( 05/0 P<). گروه درمان با آنتی‎بیوتیک اریترومایسین و شربت تیماسین‌پلاس نتایج تقریبا مشابهی داشتند و می‌توان نتیجه گرفت تیماسین‌پلاس و اریترومایسین دارای عملکردی یکسان در کاهش میزان آلودگی و آسیب بوده‌اند.

 

تفاوت نتایج در بررسی هیستوپاتولوژی با دو آزمون میکروبی دیگر، نشان داد که تغییرات مولکولی زودتر از تغییرات سلولی بوجود می‌آید.

 

تصویر5. نمودار مقایسه تخلیه بافت طحال در نمونه‌گیری اول و دوم. محور عمودی درجه‌بندی میزان آسیب بافتی و محور افقی نام گروه‌های مورد مطالعه.

 

 

تصویر6. نمودار مقایسه هموسیدروز طحال در نمونه‌گیری اول و دوم. محور عمودی درجه‌بندی میزان آسیب بافتی و محور افقی نام گروه‌های مورد مطالعه.

 

 

تصویر7. نمودار مقایسه نکروز کبد در نمونه‌گیری اول و دوم. محور عمودی درجه‌بندی میزان آسیب بافتی و محور افقی نام گروه‌های مورد مطالعه.

 

 

تصویر8. نمودار مقایسه التهاب کبد در نمونه‌گیری اول و دوم. محور عمودی درجه‌بندی میزان آسیب بافتی و محور افقی نام گروه‌های مورد مطالعه.

بحث

طی بررسی‌هایی که بین سال‌های 2021-2011 توسط Shen W و همکاران در سال 2022، Farikoski IO و همکاران در سال 2019، Oladeinde A و همکاران در سال 2019، Malek Pour و همکاران در سال 2019، استاجی و همکاران در سال 2017 و Pouyan و همکاران در سال 2021، انجام گرفت، مشخص شد، در بین 4714 ایزوله جداسازی شده از انسان، حیوانات، غذاها و محیط‌زیست، بیشترین مقادیر مقاومت نسبت به آنتی‌بیوتیک (≥ 75٪) مربوط به تتراسایکلین، آمپی‌سیلین، سولفیسوکسازول و استرپتومایسین؛ (50-75%) برای نالیدیکسیک‌اسید، آموکسی‌سیلین، اسیدکلاوولانیک و کلرامفنیکل؛ ​​(25-50%) برای تری‌متوپریم، سولفامتوکسازول، کانامایسین، تری‌متوپریم و جنتامایسین و (≤ 25%) یا کمترین میزان مقاومت به سیپروفلوکساسین، اریترومایسین، سفوتاکسیم، سفتریاکسون، سفپیم، سفتازیدیم و کولیستین بوده است (40,29–36). Aelenei P و همکاران در 2019 به مقایسه اثر دو آنتی‌بیوتیک اریترومایسین و جنتامایسین بر روی باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی پرداختند و دریافتند اریترومایسین دارای اثر مهاری بهتری بر روی سودوموناس آئروژینوزا و اشرشیاکلی نسبت به جنتامایسین است (41). در پژوهشی دیگر، Galgano و همکاران در سال 2023، به بررسی اثر چندین آنتی‌بیوتیک مختلف برروی سویه‌های سالمونلا انتریکا، اشرشیاکلی و استافیلوکوکوس اورئوس، پرداختند و دریافتند که اثر آنتی‌بیوتیکی ماکرولیدها شامل اریترومایسین، آزیترومایسین بیشتر از سایر آنتی‌بیوتیک‌ها مانند ونکومایسین، آموکسی‌سیلین، کلیندامایسین و... می‌باشد (42). با توجه به این نتایج، آنتی‌بیوتیک اریترومایسین به عنوان آنتی‌بیوتیک کاندید در این پژوهش مورد استفاده قرار گرفت. استاجی و همکاران در سال 2018، اعلام کردند، عفونت‌زایی در طیور ممکن است یک مسیر بالقوه برای ورود باکتری‌های بیماری‌زا به زنجیره غذایی و افزایش تعداد میزبان باشد (32). بنابراین انجام اقداماتی در جهت کاهش عفونت بدون ایجاد مقاومت آنتی‌بیوتیکی، امری حیاتی تلقی می‌شود. به این منظور چندین سال است، داروهای گیاهی مورد توجه همگان قرار گرفته است و به نظر می‌رسد می‌توان از آن‌ها به صورت جایگزین و یا هم‌افزایی آنتی‌بیوتیک‌ها در درمان عفونت‌های باکتریایی استفاده کرد. آویشن باغی و ختمی دو گیاه استفاده شده در این پژوهش‌اند که به تنهایی دارای خواص بسیار می‌باشند. اسانس آویشن در حال حاضر در سطح جهانی به عنوان یک نگهدارنده طبیعی مواد غذایی، با اثرات آنتی اکسیدانی، ضد باکتریایی و ضد قارچی شناخته شده است. طبق بررسی‌های بیوانفورماتیکی که Marques J و همکاران در سال 2023، حول محور اتصال مولکولی و تجزیه و تحلیل همبستگی اجزای آویشن انجام دادند، ثابت شد، اتصال و پیوند مولکولی قوی بین کارواکرول و تیمول، با حوزه‌های عملکردی پروتئین حدت، مانع از انتشار و آسیب میکروارگانیسم به سایر ارگان‌های بدن میزبان می‌شوند (43) هم‌چنین مختاری و همکاران در سال 2023، ثابت کردند که عصاره آویشن با قدرت مهار رادیکال‌های آزاد، هگزان و کلاته‌کنندگی آهن پلاسما، حائز اهمیت است؛ این ترکیبات می‌تواند با مهار آنزیم‌های باکتریایی، افزایش نفوذپذیری غشای سلولی و سنتز اجزای شبه ساختاری، ماده ژنتیکی را از نظر عملکردی مختل کند. به طور کلی عصاره‌های حاوی ترکیبات فنلی مانند تیمول، کارواکرول و اوژنول در سطوح بالا، اثر ضد میکروبی قوی بر میکروارگانیسم‌های بیماری‌زا دارند (44). Galgano و همکاران در سال 2023، از عصاره آویشن باغی به عنوان یک ترکیب ضد میکروبی برای از بین بردن سالمونلا دربی، اشرشیاکلی و استافیلوکوکوس اورئوس در بستر طیور استفاده کردند (42). گیاه ختمی حاوی پکتین 11درصد، موسیلاژ، اسید فنولیک، اسکوپولتین، فلاونوئیدها، کومارین‌ها و فیتواسترول‌ها می‌باشد و در کاهش عفونت بسیار مفید می‌باشد. گیاه ختمی دارای فواید پزشکی زیاد و بدون عوارض جانبی جدی است. این عصاره، به دلیل خواص ضد التهابی و ضد میکروبی به عنوان یک داروی گیاهی سنتی برای التیام زخم شناخته شده است. خواص موسیلاژینی، اثرات مرطوب کنندگی و تغذیه‌ای بر تکثیر سلول‌های پوستی دارد. برخی از پلی ساکاریدهای موجود در ختمی که از نوع رامنوگالاکتورونان هستند، تشکیل بافت‌های موسینی در بالای بافت‌های تحریک شده و آسیب دیده را به عهده دارند (45). به طور کلی از عصاره ختمی برای عفونت‌های دستگاه گوارش و مجاری ادراری و هم‌چنین برای التهاب، زخم، آبسه، یبوست و اسهال استفاده می‌شود. فلاونوئیدهای موجود در ختمی، تأثیر بسیار قوی‌تر از فنیل بوتازون در سرکوب فاز حاد التهاب داشتند؛ هم‌چنین فاز التهابی برخلاف فنیل بوتازون، موجب فرسایش معده نمی‌شود و وجود هیپولاتین 8-گلوکوزید، کاهش درد در بیماران را به همراه دارد (46). داروی گیاهی تیماسین‌پلاس® به طور معمول برای درمان برونشیت، گلودرد و تسکین سرفه استفاده می‌شود اما با توجه به مواد موثر این دارو که شامل آویشن باغی و ختمی می‌باشد و تاثیر ضد میکروبی هر یک از این عناصر به تنهایی، بررسی تاثیر ضدمیکروبی این دارو بر روی عفونت سالمونلا تیفی‌موریوم، به یکی از اهداف این پژوهش مبدل شد.

معصومی‌پور و همکاران در سال 1398، ثابت کردند که تاثیر ضدمیکروبی ترکیب سه عصاره کلپوره، فلفل سیاه و چای سبز بر باکتری‌های پاتوژن مقاوم به آنتی‌بیوتیک نسبت به حالت منفرد، بسیار زیاد و قابل مقایسه نیست (47) همچنین D Amenu در سال 2014، ثابت کرد ترکیب عصاره گیاهان خرزهره، جینسنگ هندی، درمنه دشتی و انجیر سیکامور نسبت به حالت تکی این عناصر، در برابر سویه‌های اشرشیاکلی، استافیلوکوکوس اورئوس، سودوموناس آئروژينوزا، اثر ضدمیکروبی بیشتری دارند (48). Moussii IM و همکاران در سال 2020 پی بردند که ترکیب سه عصاره درمنه دشتی، اسطوخودوس و رزماری اثر ضدمیکروبی زیادی بر روی سه سویه اشرشیاکلی، استافیلوکوکوس اورئوس و سودوموناس آئروژينوزا دارند (49) Malek Pour و همکاران در سال 2019 از ترکیب دو اسانس کافور و میخک برای مهار تولید TEMbla در اشرشیاکلی جدا شده از کولی باسیلوز طیور استفاده کردند و با استفاده از تست MIC ثابت کردند، ضمن اثر مهاری هر یک از این اسانس‌ها به تنهایی، ترکیب این دو نیز دارای قدرت بازدارندگی زیادی بر روی جدایه اشرشیاکلی می‌باشد (39). همچنین Pouyan و همکاران در سال 2021، به اثر مهاری اسانس دارچین و پونه چه به صورت تکی و ترکیبی با یکدیگر بر تولید bla CTX-M بر سویه‌های اشرشیاکلی با تست MIC پی بردند (40). با توجه به بررسی‌های صورت گرفته مشخص شد، ترکیب دو یا چند عصاره گیاهی، نسبت به استفاده از تک عصاره، خاصیت درمانی و ضدمیکروبی بیشتری را دارا می‌باشد و این تصور که خاصیت مواد مؤثر موجود در گیاهان در همبستگی با یکدیگر تشدید می‌شود، دور از انتظار نیست (44).

استفاده همزمان داروهای گیاهی و آنتی‌بیوتیک‌ها به نوع گیاه و ماده شیمیایی بستگی دارد و می‌تواند سه واکنش هم‌افزایی، بی اثر و مضر را از خود نشان دهد. کاهش مقدار مصرف آنتی‌بیوتیک و یا کاهش تعداد دفعات مصرف، در مقابل تاثیر ضدمیکروبی بسیار زیاد، از دلایل اهمیت و توجه به اثر هم‌افزایی آنتی‌بیوتیک با داروی گیاهی می‌باشد. مطالعات زیادی برروی بررسی اثر هم‌افزایی انجام گرفته است، بطور مثال زاهدی و همکاران در سال 1394، اثر هم‌افزایی آنتی‌بیوتیک فسفومایسین و اسانس گیاه لیمو عمانی بر روي ایزوله‌هاي مقاوم به متی‌سیلین استافیلوکوکوس اورئوس (50) محمدپور و همکاران در سال 1402، اثر هم‌افزایی آنتی‌بیوتیک کوتریموکسازول و عصاره سیاهدانه بر روی سویه‌ی استاندارد استافیلوکوکوس اورئوس، (51) اسدی و همکاران در سال 1402، اثر هم‌افزایی آنتی‌بیوتیک سفکسیم و کارواکرول بر روی باکتری اشرشیاکلی (52)، استاجی و همکاران در سال 2020، اثر هم‌افزایی آنتی‌بیوتیک اریترومایسین و بزاق زالو بر روی باکتری استافیلوکوکوس اورئوس (24) وAelenei P و همکاران در سال 2019، اثر هم‌افزایی عصاره گشنیز با آنتی‌بیوتیک اریترومایسین بر روی سودوموناس آئروژینوزا و اشرشیاکلی (41)، ثابت کردند. طبق نتایج این پژوهش‌ها، بررسی اثر هم‌افزایی داروی گیاهی تیماسین‌پلاس® و آنتی‌بیوتیک اریترومایسین، دومین هدف مورد بررسی در این پژوهش بود. 

Dar MA و همکاران در سال 2019، برای بررسی میزان بیان ژن و پاسخ آنتی بادی از DNA موجود در بافت‌های کبد، طحال و روده، جوجه‌های گوشتی چالش یافته شده با سالمونلا تیفی‌موریوم، با استفاده از آزمون Real-time PCR استفاده کردند (53) همچنین در پژوهش دیگر که در سال 2019 توسط Liu N و همکاران انجام گرفت، برای بررسی اثر بخشی مکمل تترامتیل پیرازین در کاهش میزان باکتری سالمونلا تیفی‌موریوم در جوجه‌های گوشتی، از نمونه ‌DNA موجود در بافت کبد و طحال استفاده شد و مقدار باکتری موجود با تست Real-time PCR سنجیدند (54). Malekpour و همکاران در سال 2019، برای بررسی کمی میزان اثر بخشی دو اسانس کافور و میخک بر مهار تولید TEMbla در اشرشیاکلی از تستReal-time PCR برای ردیابی ژن مورد نظر استفاده کردند (39). Pouyan و همکاران در سال 2021، از روش Real-time PCR برای بررسی میزان اثر هم‌افزایی ترکیب دو عصاره دارچین و پونه بر مهار تولید bla CTX-M در اشرشیاکلی جدا شده از  کولی باسیلوز طیور استفاده کردند (40). Raheem و همکاران در سال 2021، به بررسی اثر ضدمیکروبی دو گیاه زیره سیاه و زردچوبه بر علیه باکتری گرم منفی پاستورلامولتوسیدا در جوجه‌های گوشتی پرداختند، در این پژوهش ضمن آلودگی طیور و سپس درمان با گیاهان مدنظر، از بررسی هیستوپاتولوژی بافت کبد، طحال و ریه برای بررسی میزان اثربخشی گیاهان فوق استفاده کردند (55). در پژوهش دیگری که در سال 2020 توسط Chen C و همکاران صورت گرفت، از پروبیوتیک برای از بین بردن باکتری سالمونلا پلوروم در جوجه‌های گوشتی استفاده شد، در این پژوهش، محلول پروبیوتیک به صورت گاواژ چینه‌دان به جوجه‌ها خورانده و سپس از نمونه بافت کبد و طحال برای بررسی میزان اثر بخشی پروبیوتیک استفاده شد (56). در این پژوهش میزان آسیب بافتی و تعداد باکتری‌های موجود در بافت طحال تا حدودی بیشتر از بافت کبد گزارش شد که بنظر می‌رسد دلیل این اتفاق به مکانسیم عمل این دو بافت بر‌می‌گردد. از آنجایی که بافت طحال بزرگترین بافت لنفاوی بدن است و مسئولیت فاگوسیتوز و تصفیه خون برعهده دارد، پس بالا بودن آسیب و تغییرات بالای مورفولوژی مانند پرخونی و.. در این بافت دور از انتظار نیست. 

نتیجه‌گیری نهایی

با مطالعه نتایج حاصل از تست‌های Real-time PCR، شمارش کلونی در دو محیط  SS آگار و بلاد آگار و بررسی‌های پاتولوژی، مشخص شد، شربت تیماسین‌پلاس® توانسته میزان باکتری را کاهش دهد و نتایجی شبیه به گروه درمان با آنتی‌بیوتیک اریترومایسین داشته باشد، اما بطور کلی ترکیب شربت تیماسین‌پلاس® و آنتی‌بیوتیک اریترومایسین بهترین نتایج را نشان داد و مؤفق‌ترین گروه در کاهش میزان باکتری بوده است و مشخص شد، ترکیب این دو ماده نه تنها برای بیمار، ضرری ندارد بلکه می‌توان با استناد به اثر هم‌افزایی، بجای استفاده از آنتی‌بیوتیک در دوز بالا یا مدت زمان بیشتر، از این ترکیب در زمان کوتاه‌تر و مقدار آنتی‌بیوتیک کمتر، بهترین نتیجه را مشاهده کرد.

تاییدیه اخلاقی

پژوهش حاضر با کد اخلاق IR.SU.REC.1402.6، در دانشکده دامپزشکی دانشگاه سمنان و طبق دستورالعمل‌ها کمیته اخلاق، انجام گرفت.

تعارض منافع

بین نویسندگان، تعارض در منافع گزارش نشده است.

منابع

1. Wu Y, Luo L, Wang Y, Chen X, Mo D, Xie L SA. Strengthened public awareness of one health to prevent zoonosis spillover to humans. (2023). Science of the Total Environment, 879: 163200. 

2. Marchello CS, Birkhold M, Crump JA, Martin LB, Ansah MO, Breghi G, Canals R, Fiorino F, Gordon MA, Kim JH HM. Complications and mortality of non-typhoidal salmonella invasive disease: a global systematic review and meta-analysis. (2022). The Lancet Infectious Diseases.

3.Javan J, Staji, H., Ghazvinian, K., Javaheri Vayeghan, A., Salimi, M. R., Mahdavi A. Prevalence of Salmonella spp. in the quail egg interior contents: A provincial study. (2012). Iranian Journal of Veterinary Medicine, 6:191–6. 

4. Álvarez-Ordóñez A, Begley M, Prieto M, Messens W, López M, Bernardo A HC. Salmonella spp. survival strategies within the host gastrointestinal tract. (2011). Microbiology, 157: 3268–81. 

5. Galán JE. Salmonella Typhimurium and inflammation: a pathogen-centric affair. (2021). Nature Reviews Microbiology, 19: 716–25. 

6. Balasubramanian D, López-Pérez M, Grant TA, Ogbunugafor CB A-MS. Molecular mechanisms and drivers of pathogen emergence. (2022). Trends in Microbiology.

7. Xiong L, Wang S, Dean JW, Oliff KN, Jobin C, Curtiss III R ZL. Group 3 innate lymphoid cell pyroptosis represents a host defence mechanism against Salmonella infection. (2022). Nature Microbiology, 7: 1087–99. 

8. Wibisono FM, Wibison FJ, Effendi MH, Plumeriastuti H, Hidayatullah AR, Hartadi EB SE. A review of salmonellosis on poultry farms: Public health importance. (2020). Systematic Reviews in Pharmacy, 11: 481–6.  

9. El-Saadony MT, Salem HM, El-Tahan AM, Abd El-Mageed TA, Soliman SM, Khafaga AF, Swelum AA, Ahmed AE, Alshammari FA AE-HM. The control of poultry salmonellosis using organic agents: an updated overview. (2022). Poultry Science, 101: 101716. 

10. Jibril AH, Okeke IN, Dalsgaard A, Menéndez VG OJ. Genomic analysis of antimicrobial resistance and resistance plasmids in Salmonella serovars from poultry in Nigeria. (2021). Antibiotics, 10: 99-112. 

11. Hao G, Li P, Huang J, Cui K, Liang L, Lin F, Lu Z SS. Research Note: Therapeutic effect of a Salmonella phage combination on chicks infected with Salmonella Typhimurium. (2023). Poultry Science, 102: 102715.  

12. Hossain MJ, Attia Y, Ballah FM, Islam MS, Sobur MA, Islam MA, Ievy S, Rahman A, Nishiyama A, Islam MS HJ. Zoonotic significance and antimicrobial resistance in Salmonella in poultry in Bangladesh for the period of 2011–2021. (2021). Zoonotic Diseases. 1: 3–24. 

13. Barreto, M., Castillo-Ruiz, M. and Retamal P. Salmonella enterica: a review or the trilogy agent, host and environment and its importance in Chile. (2016). Revista chilena de infectología, 33: 547–57. 

14. Marquardt, R.R. and Li S. Antimicrobial resistance in livestock : advances and alternatives to antibiotics. (2018). Animal Frontiers, 8: 30–37. 

15. Castellanos, L.R., van der Graaf-van Bloois, L., DonadoGodoy, P., León, M., Clavijo, V., Arévalo, A., Bernal JF, Mevius, D.J., Wagenaar, J.A., Zomer, A. and Hordijk J. Genomic Characterization of Extended-Spectrum Cephalosporin-Resistant Salmonella enterica in the Colombian Poultry Chain. (2018). Frontiers in Microbiology, 9: 1–11. 

16. Pan, H., Paudyal, N., Li, X., Fang, W. and Yue M. Multiple food-animal-borne route in transmission of antibiotic-resistant Salmonella Newport to humans. (2018). Frontiers in Microbiology, 9: 1–10.

17. WHO. List of Critically Important Antimicrobials for Human Medicine. (2019).

18. WHO. Model List of Essential Medicines. (2019).

19. Xu Z, Dong M, Yin S, Dong J, Zhang M, Tian R, Min W, Zeng L, Qiao H CJ. Why traditional herbal medicine promotes wound healing: research from immune response, wound microbiome to controlled delivery. (2023). Advanced Drug Delivery Reviews, 195: (114764). 

20. Antih J, Houdkova M, Urbanova K KL. Antibacterial activity of Thymus vulgaris L. essential oil vapours and their GC/MS analysis using solid-phase microextraction and syringe headspace Sampling Techniques. (2021). Molecules, 26. 

21. Kaeidi A, Rahmani M HJ. The Protective Effect of Carvacrol and Thymol as Main Polyphenolic Compounds of Thyme on Some Biologic Systems in Disease Condition: A Narrative Review. (2020). Journal of Rafsanjan University of Medical Sciences, 19: 81–96. 

22. Mahboubi M. Marshmallow (Althaea officinalis L.) and its potency in the treatment of cough. (2020). Complementary Medicine Research, 27: 174–83.

23. Zareii B, Seyfi T, Movahedi R, Cheraghi J ES. Antibacterial Effects of Plant Extracts of Alcea Digitata L., Satureja Bachtiarica L. and Ferulago Angulata L. (2014). Journal of Babol University of Medical Sciences, 16: 31–7. 

24. Gerivani B,Staji H, Rassouli M, Ghazaleh N VA. Co-administration of erythromycin and leech salivary extract alleviates osteomyelitis in rats induced by methicillin-resistant Staphylococcus aureus. (2020). Veterinary and Comparative Orthopaedics and Traumatology, 33: 243–51. 

25. Owuama CI. Determination of minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) using a novel dilution tube method. (2017). African Journal of Microbiology Research, 11: 977–80. 

26. Lopes PD, Freitas Neto OC, Batista DFA, Denadai J, Alarcon MFF, Almeida AM et al. Experimental infection of chickens by a flagellated motile strain of Salmonella enterica serovar Gallinarum biovar Gallinarum. (2016). The Veterinary Journal, 214: 40–6. 

27. Bustamante E, Guijarro E, García-Diego FJ, Balasch S, Hospitaler A TA. Multisensor system for isotemporal measurements to assess indoor climatic conditions in poultry farms. (2012). Sensors, 12: 5752–74. 

28. Gutierrez A SK. Survival and inactivation kinetics of Salmonella enterica serovar Typhimurium in irradiated and natural poultry litter microcosms. (2022). PLoS One, 17: e0267178. 

29. Staji H, Khoshgoftar J, Javaheri Vayeghan A BM. Phylogenetic grouping and assessment of virulence genotypes, with antibiotic resistance patterns, of Escherichia coli strains implicated in female urinary tract infections. (2017). International Journal of Enteric Pathogens, 4: 1–7. 

30. Staji H, Tonelli A, Javaheri-Vayeghan A, Changizi E S-BM. Distribution of Shiga toxin genes subtypes in B1 phylotypes of Escherichia coli isolated from calves suffering from diarrhea in Tehran suburb using DNA oligonucleotide arrays. (2015). Iranian Journal of Microbiology, 7: 191–7. 

31. Flores-Ramírez A, Ortega-Cuenca J, Cuetero-Martínez Y, de Los Cobos D NA. Viability and removal assessment of Escherichia coli and Salmonella spp. by real-time PCR with propidium monoazide in the hygienization of sewage sludge using three anaerobic processes. (2023). Waste Management, 161: 254–62. 

32. Staji H, Birgani SF RB. Comparative clustering and genotyping of Campylobacter jejuni strains isolated from broiler and turkey feces by using RAPD-PCR and ERIC-PCR analysis. (2018).  Annals of Microbiology, 68: 755–62. 

33. Farikoski IO, Medeiros LS, Carvalho YK, Ashford DA, Figueiredo EE, Fernandes DV, Silva PJ RV. The urban and rural capybaras (Hydrochoerus hydrochaeris) as reservoir of Salmonella in the western Amazon, Brazil. (2019). Pesquisa Veterinária Brasileira, 39: 66–9. 

34. Zhou Z, Pan C, Lu Y, Gao Y, Liu W, Yin P YX. Combination of erythromycin and curcumin alleviates Staphylococcus aureus induced osteomyelitis in rats. (2017). Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 7: 379–89. 

35. Bescucci DM, Moote PE, Ortega Polo R, Uwiera RR IG. Salmonella enterica serovar Typhimurium temporally modulates the enteric microbiota and host responses to overcome colonization resistance in swine. (2020). Applied and Environmental Microbiology, 86: e01569-20. 

36. Shen W, Chen H, Geng J, Wu RA, Wang X DT. Prevalence, serovar distribution, and antibiotic resistance of Salmonella spp. isolated from pork in China: A systematic review and meta-analysis. (2022). International Journal of Food Microbiology, 361: 109473. 

37. Qin X, Yang M, Cai H, Liu Y, Gorris L, Aslam MZ, Jia K, Sun T, Wang X DQ. Antibiotic resistance of Salmonella Typhimurium monophasic variant 1, 4,[5], 12: I: -in China: a systematic review and meta-analysis. (2022). Antibiotics, 11: 532- 540. 

38. Wu LJ, Luo Y, Shi GL LZ. Prevalence, clinical characteristics and changes of antibiotic resistance in children with nontyphoidal Salmonella infections from 2009–2018 in Chongqing, China. (2021). Infection and Drug Resistance, 13: 1403–13. 

39. Malekpour B, Kafshdouzan K, Javan AJ BM. Inhibition of TEMbla Producing Escherichia coli Isolated From Poultry Colibacillosis Using Cinnamomum camphora and Syzygium aromaticum Essential Oils. (2019). Avicenna Journal of Clinical Microbiology and Infection, 6: 88–94. 

40. Pouyan S, Kafshdouzan K JA. Synergistic Effect of Cinnamomum camphora and Origanum vulgare Essential Oils against bla CTX-M Producing Escherichia coli Isolated from Poultry Colibacillosis. (2021). Journal of Medical Bacteriology, 10: 20–9.

41. Aelenei P, Rimbu CM, Guguianu E, Dimitriu G, Aprotosoaie AC, Brebu M, Horhogea CE MA. Coriander essential oil and linalool–interactions with antibiotics against Gram‐positive and Gram‐negative bacteria. (2019). Letters in Applied Microbiology, 68: 156–64. 

42. Galgano M, Pellegrini F, Fracchiolla G, Mrenoshki D, Zarea AA, Bianco A, Del Sambro L, Capozzi L, Schiavone A, Saleh MS CM. Pilot Study on the Action of Thymus vulgaris Essential Oil in Treating the Most Common Bacterial Contaminants and Salmonella enterica subsp. enterica Serovar Derby in Poultry Litter. (2023). Antibiotics, 12: 436–48. 

43. Monteiro Marques J, Serrano S, Selmi H, Giesteira Cotovio P S-LT. Antimicrobial and Antibiofilm Potential of Thymus vulgaris and Cymbopogon flexuosus Essential Oils against Pure and Mixed Cultures of Foodborne Bacteria. (2023). Antibiotics, 12. 

44. Mokhtari R, Kazemi Fard M, Rezaei M, Moftakharzadeh SA MA. Antioxidant, Antimicrobial Activities, and Characterization of Phenolic Compounds of Thyme (Thymus vulgaris L.), Sage (Salvia officinalis L.), and Thyme–Sage Mixture Extracts. (2023). Journal of Food Quality.

45. Ayrle H, Mevissen M, Kaske M, Nathues H, Gruetzner N, Melzig M WM. Medicinal plants–prophylactic and therapeutic options for gastrointestinal and respiratory diseases in calves and piglets? A systematic review. (2016). BMC Veterinary Research, 12: 1–31. 

46. Pausan MR. Marshmallow and its action on inflamed 3D skin model mimicking atopic dermatitis. (2022). Planta Medica, 88: 1474–80. 

47. Masoumipour F, Hassanshahian M, Sasan H JT. Antimicrobial Effect of Combined Extract of Three Plants Camellia Sinensis, Teucrium Polium and Piper Nigrum on Antibiotic Resistant Pathogenic Bacteria. (2019). Iranian Journal of Medical Microbiology, 13: 114–24. 

48. Amenu D. Antimicrobial activity of medicinal plant extracts and their synergistic effect on some selected pathogens. (2016). American Journal of Ethnomedicine, 1: 18–29. 

49. Moussii IM, Nayme K, Timinouni M, Jamaleddine J, Filali H HF. Synergistic antibacterial effects of Moroccan Artemisia herba alba, Lavandula angustifolia and Rosmarinus officinalis essential oils. (2020). Synergy, 10: 25-31. 

50. Zahedi B , Eghbal J, Zartoshti M HJN. Evaluation of the synergistic effect of phosphomycin and citrus aurantifolia’s essential oil on methicilin resistant Staphylococcus aureus isolates. (2015). Studies in Medical Sciences, 26: 327–33.

51. Mohammadpour P, Ahmadi M, Niakan M, Rahimi F HF. Survey the synergistic effect of the cotrimoxazole and Nigella sativa extract on methicillin resistant Staphylococcus aureus bacteria. (2023). Daneshvar Medicine, 31: 13–22. 

52. Asadi S, Nayeri Fasaei B, Zahraei Salehi T, Yahya Rayat R SN. Evaluation of the Antibacterial Effect of Carvacrol Alone and in Combination with the Antibiotic Cefixime Against Escherichia coli O157:H7. (2023). Journal of Veterinary Research, 78: 67–76. 

53. Dar MA, Urwat U, Ahmad SM, Ahmad R, Kashoo ZA, Dar TA, Bhat SA, Mumtaz PT, Shabir N, Shah RA HM. Gene expression and antibody response in chicken against Salmonella Typhimurium challenge. (2019). Poultry Science, 98: 2008–13. 

54. Liu N, Lin L, Wang JQ, Zhang FK WJ. Tetramethylpyrazine supplementation reduced Salmonella Typhimurium load and inflammatory response in broilers. (2019). Poultry Science, 98: 3158–64. 

55. Raheem MA, Jiangang H, Yin D, Xue M, ur Rehman K, Rahim MA, Gu Y, Fu D, Song X, Tu J KI. Response of lymphatic tissues to natural feed additives, curcumin (Curcuma longa) and black cumin seeds (Nigella sativa), in broilers against Pasteurella multocida. (2021). Poultry Science, 100: 152–64. 

56. Chen C, Li J, Zhang H, Xie Y, Xiong L, Liu H WF. Effects of a probiotic on the growth performance, intestinal flora, and immune function of chicks infected with Salmonella pullorum. (2020). Poultry Science, 99: 5316–23. 

 

 

Stady of the effect of Tymasin Plus® herbal medicine on experimental oral infection of Salmonella typhimurium in broilers.

Zahra Davoodi1 ,Hamid Staji2*, Sahar Ghaffari Khaligh3, Hesameddin Emadi Chashmi4

1- Master's student, Department of Microbial Biotechnology, Faculty of New Technology, Semnan University, Semnan, Iran.

2- Associate professor, Department of Pathobiology, Faculty of Veterinary Medicine, Semnan University, Semnan, Iran. 

3- Assistant professor, Department of Pathobiology, Faculty of Veterinary Medicine, Semnan University, Semnan, Iran. 

4- Assistant professor, Department of Clinical Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, Semnan University, Semnan, Iran. 

 

Abstract

Salmonella typhimurium is one of the most important and pathogenic salmonellas that lead to infection in humans, livestock and poultry, and it causes a reduction in production and subsequent economic losses in the poultry industry. Using antibiotics to reduce side effects and kill bacteria in different doses leads to the development of resistance. In plants, the antimicrobial property is inherent in the constituent elements, so they do not accumulate in the body and do not cause the side effects of antibiotics, such as antibiotic resistance, allergic reactions, stomach problems, etc. The present study was conducted to investigate the antimicrobial effect of the herbal medicine Tymasin Plus® and the synergistic effect of this medicine with the antibiotic erythromycin on Salmonella Typhimurium infection in one-day-old chickens Ras 308. For this purpose, 40 one-day-old chickens of Ras 308 breed were used in four groups of ten. An amount of 2 ml of suspension containing 106 CFU of Salmonella typhimurium bacteria was experimentally induced to all chickens by gastric tube by layer gavage method. The experimental treatments included negative control (induction of infection but without therapeutic interventions), treatment with erythromycin antibiotic, treatment with Tymasin Plus® syrup (containing Thymus Vulgaris and Althea Officinalis extract), and treatment with the combination of erythromycin antibiotic and Tymasin Plus® syrup. The treatment started 24 hours after the induction of infection and continued until one day before sampling. On the fourth and twelfth days, after death, the liver and spleen tissues were separated for microbial nvestigations, including colony counting, Real-time PCR test, and tissue damage. The results of real-time PCR test and colony count confirmed that Tymasin Plus® syrup has an antimicrobial effect on Salmonella Typhimurium bacteria. In this study, the highest number of bacteria was specific to the control group and the lowest amount was related to the group treated with erythromycin and Tymasin Plus®; Also, in the study of histopathology results of liver and spleen tissue, a significant difference was observed between the control group and other groups. According to this research, it was found that the herbal medicine Tymasin Plus® has the same function as erythromycin and is effective in reducing the population of Salmonella Typhimurium bacteria synergistically with erythromycin. Considering the phenomenon of antibiotic resistance, it is better to use herbal medicines or a combination of herbal medicine and antibiotic instead of using chemicals.

Key words: Salmonella Typhimurium, Tymasin Plus® Syrup, Real-time PCR, Thymus vulgaris, ALthea officinalis.

Graphical Abstract

 

 

*Corresponding author: Hamid Staji

Address: Department of Pathobiology, Faculty of Veterinary Medicine, Semnan University, Semnan, Iran.

E. mail: [e-mail]

 

---