سنتز سبز نانوذرات روی و بررسی تغییرات آن بر روی آنزیمهای کبدی و تأثیر آن بر ترمیم زخمهای ناشی از سوختگی در رتهای نر از نژاد ویستار آزمایشگاهی
الموضوعات : مجله پلاسما و نشانگرهای زیستیزهرا سینایی پور فرد 1 , نوشین نقش 2 , نسرین یزدانپناهی 3 , غلامرضا امیری 4
1 - گروه زیست شناسی، واحد فلاورجان، دانشگاه آزاد اسلامی، اصفهان
2 - گروه زیست شناسی، واحد فلاورجان، دانشگاه آزاد اسلامی، اصفهان، ایران.
3 - گروه بیوتکنولوزی ، دانشگاه آزاد اسلامی واحد فلاورجان، اصفهان، ایران
4 - گروه فیزیک، واحد فلاورجان، دانشگاه آزاد اسلامی، اصفهان، ایران
الکلمات المفتاحية: پارامترهای بیوشیمیایی, ترمیم زخم, نانوذرات سبز روی,
ملخص المقالة :
زمینه و هدف: در حال حاضر روی و ترکیبات آن به عنوان یک راه حل مناسب برای درمان عفونت در سوختگی ها، زخم های باز و زخم های مزمن به کار برده می شوند. این مطالعه با هدف بررسی اثر موضعی نانوذرات سبز روی بر روی پارامترهای بیوشیمایی خون و ترمیم بافت پوست در هنگام ترمیم زخم در موش سفید آزمایشگاهی طراحی و اجرا شد.مواد و روش ها : در این تحقیق تجربی، 42 رت نر از نژاد ویستار به 7 گروه 6 تایی مورد بررسی قرار گرفتند. سپس با ایجاد سوختگی به اندازه 2 سانتیمتر در پشت رت ها ایجاد و بلافاصله تیمار با پماد نانوذرات روی(1%، 4%، 16%) و پماد زینک اکساید و وازلین خالص به مدت 21 روز انجام شد. پس از نمونه گیری از پوست رت ها درصد بهبود زخم در آن ها محاسبه شد. همچنبن از قلب رت ها خونگیری انجام شد و سرم خون رت ها برای بررسی پارامتر های بیوشیمیایی استفاده شد.نتایج: درصد بهبود زخم در گروه پماد 4 درصد و پماد زینک اکساید نسبت به گروه کنترل به طور معنی داری بیشتر بود. در ضمن تمامی غلظت های به کاربرده شده در این تحقیق، از نظر تاثیر برروی آنزیم های کبدی ایمن بودند.نتیجه گیری: نتایج نشان داد که پماد 4% نانوذرات روی بهترین گروه تیمار بوده که باعث تسریع بهبود زخم های پوستی شد. بر اساس نتایج مطالعه حاضر، پماد تولید شده توسط نانوذرات سبز شناسایی شده احتمالاً می تواند به عنوان یک ترمیم کننده قوی در ضایعات پوستی به طور طبیعی مورد استفاده قرار گیرد.
2. Atta AM, Al-Lohedan HA, Ezzat AO. Synthesis of silver nanoparticles by green method stabilized to synthetic human stomach fluid. Molecules. 2014;19(5):6737-53.3. Poovizhi J, Krishnaveni B. Synthesis, characterization and antimicrobial activity of zinc oxide nanoparticles synthesized from calotropis procera. Int J Pharmaceut Sci Drug Res. 2015; 7(5): 425-431.4. Karimi J, Mohsenzadeh S. Plant synthesis of silver nanoparticles by Achilleawilhelmsii Pharmaceutical plant. Razi Journal of Medical Sciences. 2013; 20(111): 64-9.
6. Ramesh P, Rajendran A, Meenakshisundaram M. Green syntheis of zinc oxide nanoparticles using flower extract cassia auriculata. J NanoSci NanoTechnol. 2014; 2(1): 41-5.
7. Jamdagni P, Khatri P, Rana JS. Nanoparticles based DNA conjugates for detection of pathogenic microorganisms. Int Nano Lett. 2016; 6(3):139-46.
8. Ahmed S, Ahmad M, Swami BL, Ikram S. A review on plants extract mediated synthesis of silver nanoparticles for antimicrobial applications: a green expertise. J Adv Res. 2016; 7(1):17-28.
9. Handy RD, von der Kammer F, Lead JR, Hassellöv M, Owen R, Crane M. The ecotoxicology and chemistry of manufactured nanoparticles. Ecotoxicology. 2008;17(4):287-314.
and oxidant/antioxidant status in male rats. Biol Health Sci. Bulletin 2011; 3: 1-11.
_||_
2. Atta AM, Al-Lohedan HA, Ezzat AO. Synthesis of silver nanoparticles by green method stabilized to synthetic human stomach fluid. Molecules. 2014;19(5):6737-53.3. Poovizhi J, Krishnaveni B. Synthesis, characterization and antimicrobial activity of zinc oxide nanoparticles synthesized from calotropis procera. Int J Pharmaceut Sci Drug Res. 2015; 7(5): 425-431.4. Karimi J, Mohsenzadeh S. Plant synthesis of silver nanoparticles by Achilleawilhelmsii Pharmaceutical plant. Razi Journal of Medical Sciences. 2013; 20(111): 64-9.
6. Ramesh P, Rajendran A, Meenakshisundaram M. Green syntheis of zinc oxide nanoparticles using flower extract cassia auriculata. J NanoSci NanoTechnol. 2014; 2(1): 41-5.7. Jamdagni P, Khatri P, Rana JS. Nanoparticles based DNA conjugates for detection of pathogenic microorganisms. Int Nano Lett. 2016; 6(3):139-46.
9. Handy RD, von der Kammer F, Lead JR, Hassellöv M, Owen R, Crane M. The ecotoxicology and chemistry of manufactured nanoparticles. Ecotoxicology. 2008;17(4):287-314.
and oxidant/antioxidant status in male rats. Biol Health Sci. Bulletin 2011; 3: 1-11.
زهرا سینایی پور فرد1، نوشین نقش2، نسرین یزدان پناهی3، غلامرضا امیری4
1-دانشجوی دکتری فیزیولوژی ، گروه زیست شناسی، واحد فلاورجان، دانشگاه آزاد اسلامی، اصفهان، ایران.
2- دانشیار گروه زیست شناسی، واحد فلاورجان، دانشگاه آزاد اسلامی، اصفهان، ایران. نویسنده مسئول: n_naghsh@yahoo.com
3- استادیار گروه بیوتکنولوژی، واحد فلاورجان، دانشگاه آزاد اسلامی، اصفهان، ایران.
4- دانشیار گروه فیزیک، واحد فلاورجان، دانشگاه آزاد اسلامی، اصفهان، ایران.
تاریخ دریافت:18/02/1401 تاریخ پذیرش: 02/06/1401
چکیده
زمینه و هدف: در حال حاضر روی و تركيبات آن به عنوان يك راه حل مناسب براي درمان عفونت در سوختگيها، زخمهاي باز و زخمهاي مزمن به كار برده ميشوند. اين مطالعه با هدف بررسي اثر موضعي نانوذرات سبز روی بر روي پارامترهاي بيوشيمايي خون و ترمیم بافت پوست در هنگام ترميم زخم در موش سفيد آزمايشگاهي طراحي و اجرا شد.
مواد و روش ها : در این تحقیق تجربی، 42 رت نر از نژاد ویستار به 7 گروه 6 تایی مورد بررسی قرار گرفتند. سپس با ایجاد سوختگی به اندازه 2 سانتیمتر در پشت رتها ایجاد و بلافاصله تیمار با پماد نانوذرات روی(1%، 4%، 16%) و پماد زینک اکساید و وازلین خالص به مدت 21 روز انجام شد. پس از نمونه گیری از پوست رتها درصد بهبود زخم در آنها محاسبه شد. همچنبن از قلب رتها خونگیری انجام شد و سرم خون رتها برای بررسی پارامترهای بیوشیمیایی استفاده شد.
نتایج: درصد بهبود زخم در گروه پماد 4 درصد و پماد زینک اکساید نسبت به گروه کنترل به طور معنی داری بیشتر بود. در ضمن تمامی غلظتهای به کاربرده شده در این تحقیق، از نظر تاثیر برروی آنزیمهای کبدی ایمن بودند.
نتیجه گیری: نتایج نشان داد که پماد 4% نانوذرات روی بهترین گروه تیمار بوده که باعث تسریع بهبود زخمهای پوستی شد. بر اساس نتایج مطالعه حاضر، پماد تولید شده توسط نانوذرات سبز شناسایی شده احتمالاً میتواند به عنوان یک ترمیمکننده قوی در ضایعات پوستی به طور طبیعی مورد استفاده قرار گیرد.
کلمات کلیدی: نانوذرات سبز روی، ترمیم زخم، پارامترهای بیوشیمیایی
مقدمه
نانو فناوری امروزه شاهد پیشرفتهای چشمگیری در زمینه تولید نانومواد و استفاده از روشها و مواد جدید بوده است، با توسعه و کشف روشهای جدید و نگرانیها در مورد آلودگی محیط زیست توسط نانوذرات از طریق روشهای شیمیایی و محصولات جانبی آنها بیشتر شده است، بنابراین نیاز به روشهای شیمی سبز که سالم، غیر سمی و سازگار با محیط زیست هستند احساس میشود(1و2). لذا نانوذرات سنتز شده به روشهای بیولوژیک بخاطر داشتن ویژگیهای نوین و همچنین سازگاری با محیط زیست نقش مهمی را در پزشکی نوین بر عهده دارد(3). استفاده از موجودات زنده مانند میکروارگانیسمها از قبیل قارچ، باکتری، مخمر، اکتینومیست و یا ماکرو ارگانیسمها مثل گیاهان، جلبکها به عنوان واسطه ای در سنتز نانوذرات از ترکیبات معدنی، میتوانند روشی دیگر در کنار روشهای شیمیایی و فیزیکی برای تولید نانوذرات به حساب آیند. سنتز سبز، در واقع یک روش پایین به بالا است با این تفاوت که در روش پایین به بالا یک ماده شیمیایی به عنوان حلال و نیز کاهنده عمل می کند ولی در سنتز زیستی عصاره طبیعی محصولات زیستی مانند برگ، دانه و یا میوهها برای سنتز نانوذرات مورد استفاده قرار می گیرد. عصارههای گیاهی ممکن است هم به عنوان عوامل کاهنده و هم کنترل کننده رشد نانوذرات در سنتز سبز نانوذرات، عمل نمایند. نوع عصاره مورد نیاز برای سنتز سبز، با توجه به ویژگیهای شناخته شده نانوذرات انتخاب می شود. چرا که عصارههای مختلف حاوی غلظتها و ترکیبهای متفاوت از مواد گوناگون آلی هستند. سنتز سبز این نانوذرات و مکانیسم آنها وابسته به ترکیبات شیمیایی موجود در گیاهان مانند آلکالوئید ها، فنولها، فلاونوئیدها، تاننها، ساپونینها، ترپنوئیدها و غیره می باشد. بنابراین این ترکیبات گیاهی نقش مهمی را در سنتز سبز نانوذرات ایفا می کنند(4). به طور کلی روشهای تولید زیستی نانوذرات نسبت به روشهای فیزیکی و شیمیایی به دلیل کاهش هزینه، انرژی و زمان اولویت دارد، این روش نیازمند استفاده از حلالهای سمی و مواد خطرناک برای محیط زیست نمیباشند. تولید سبز نانوذرات روشی دوستدار طبیعت است که در آن از حلالهای طبیعی استفاده میشود ساخت و تجمع نانوذرات با استفاده از روشهای شیمی سبز از سال 1990 مورد توجه واقع شد و در طی زمان استفاده از گیاهان سبز برای تهیه زیستی نانوذرات تا حدودی شناخته شده است(5). لذا گیاهان و فرآوردههای گیاهی در جهت تولید نانوذرات خیلی بیشتر مورد توجه محققین واقع شده است. علاوه بر این، نانوذرات تولید شده توسط گیاهان دارویی با ریسک کمتری میتواند در مواردی مانند انتقال دارو کاربرد داشته باشد. همچنین تحقیقات نشان داده که نانوذرات ساخته شده توسط گیاهان نسبت به نانوذرات حاصل از فعالیت سایر موجودات سریعتر ساخته شده و با ثبات تر میباشند(6). نانوذرات در سطح جهانی با توجه به ویژگیهای منحصر به فردی که دارند میتوانند در زمینههایی مثل تشخیص نانوپزشکی و خواص ضد میکروبی کاربرد داشته باشند. (8و7). یکی از مهمترین نانوذرات اکسید روی میباشد که در اکثر کشورها به شکل صنعتی مورد استفاده قرار گرفته است استفاده از نانوذرات روی در لوازم آرایشی باعث ایجاد رادیکالهای آزاد در پوست می شود و بنابراین میتواند به DNA و پروتئینهای این سلولها آسیب برساند و در نهایت منجر به سرطان شود (9).
همچنین این نانو ذره در زمینهی بیولوژی، داروسازی و پزشکی کاربرد زیادی دارد نانو مواد به دلیل بروز خواص زیادی که ناشی از سطح موثر و واکنش پذیری زیاد آنها است مورد توجه قرار دارند. از طرف دیگر با پیشرفتهای سریع در نانوفناوری، نانو مواد با اشکال و اندازههای بسیار متنوعی ساخته شده و در تولید محصولات و ابزارهای مختلف صنعتی و پزشکی به کار میروند(10). روی یکی از عناصر کمیاب (Trace element) است که مقادیر کم آن برای بدن ضروری است، اما در مقادیر بالا سمی است و قادر به القای آپوپتوز(Apoptosis) و نکروز(Necrosis) است. رایجترین ترکیب روی شکل اکسید آن(ZnO) است که استفاده از آن به دلیل این که بالاترین غلظت عنصر روی را در خود دارد و دیگر آنکه جذب آن در بدن زیـاد است و دستگـاه گوارش آن را بهتر تحمل میکند، ترجیح داده میشود. نانو اکسید روی یکی از انواع جدید روی با خاصیت بیولوژیکی خاص و سمیت کم است که کارایی لازم برای تقویت دفاع آنتی اکسیدانی دارد و در عین حال دارای قدرت جذب بیشتری نسبت به دیگر ترکیبات محتوی روی است. از طرفی به دلیل اینکه رونویسی DNA بخش مهمی از تکوین سلولهای جنسی است، روی عنصر حیاتی برای تولید سلولهای جنسی محسوب میشود و علاوه بر آن نقش ضد آپوپتوزی و خواص آنتی اکسیدانی روی نیز به اثبات رسیده است نانو ذره اکسید روی همانند نانوذرات دیگر دارای خواص کاتالیستی، مغناطیسی، نوری و بیولوژیکی(ضد میکروبی) خاصی میباشد( 11). استفاده از این نانوذره برای درمان عفونت زخمهای سوختگی توسعه پیدا کرده است(12). اما سمیت پوستی احتمالی نانوذرات باعث نگرانی شده است(13). ارتباط قوی و همبستگی مثبتی بین آنزیمهای کبدی و درجه سوختگی وجود دارد. علت افزایش آنزیمهای کبدی (AST,ALT,ALP) به دلیل آسیب سلولهای کبدی است. بازیابی عملکرد کبد باعث بهبود عوارض و مرگ و میر بیماران سوختگی شدید میشود (14). افزایش آنزیمهای کبدی بلافاصله پس از آن ناشی از شعله ور شدن کبد است که منجر به آسیب گرانولهای کبدی با آزاد شدن آنزیمهای کبدی میشود. البته نوع سمیت تولید شده توسط نانوذرات، به ویژگیها و مسیر ورود آن ها به داخل سیستم زنده بستگی دارد(15) و نانوذرات، با قطر و غلظت متفاوت دارای توزیع و اثر متفاوت در بافتهای بدن میباشند.(16). پس یکی از ویژگیهای مهم نانوذرات، برای تعیین انتشار آنها در شرایط زنده، سرنوشت بیولوژیکی مسمومیت و توانایی هدف قرار دادن آنها اندازه آنها میباشد(12). هر چه قطر نانوذرات کوچک تر باشد، نفوذ آنها به سلولها و اثرات
مولکولی آنها بر ساز و کارهای داخل سلول افزایش مییابد (18و17). مطالعات نشان داده که نانوذرات بر روی فعالیت آنزیمهای مختلف کبدی تأثیر دارد. آلانین آمینو ترانسفراز(ALT) مهمترین آنزیم گروه آمینو ترانسفراز میباشد که با انتقال واحدهای آمین، آلفا-کتواسید را به آمینو اسیدها کاتالیز میکنند. این آنزیمها جزو آنزیمهای غیر عملکردی پلاسما میباشد که در ارزیابی وضعیت کبد و حضور در پلاسما خون اطلاعاتی در مورد آسیب یا صدمه بافت کبد میدهد و مشخص شده که نشت آنزیمهای کبدی به داخل خون دلیل قوی بر آسیبهای کبدی میباشد. نانوذرات قادر به عبور از غشاهای زیستی هستند و بـه سلولها، بـافتها و اعضایی کـه اجـازه عبور مواد در اندازههای معمول را نمیدهند وارد می شوند. محققان طی مطالعاتی دریافتند که آنزیم ALT برای کبد اختصاصی بوده و آسیب سلولهای کبدی باعث افزایش آزاد شدن این آنزیم میگردد بنابراین یکی از دلایل انتخاب آنزیم ALT در این مطالعه، بررسی اثرات احتمالی تخریبی نانوذرات اکسید روی بر سلولهای کبدی بوده است (19). پس با توجه به اهمیت بررسی مقایسهای نانوذرات شیمایی روی و عدم سنجش تاثیرات ترمیم کننده روی بر زخمهای پوستی و نانوذرات در محیط زیست یافت میشوند و در علم پزشکی مورد استفاده قرار میگیرند. با این حال، قرار گرفتن در معرض نانوذرات و ارتباط آنها با سایر اجزا و میکرومولکولها میتواند منجر به سرطان شود. اما به نظر میرسد که روی سلولهای غیر سرطانی نیز تأثیر منفی دارد. تحقیقات نشان میدهد که نانوذرات میتوانند ژنی را ایجاد کنند که تصور میشود محرکی برای رشد سرطان باشد (20). به همین دلیل تصمیم بر این شد که در این تحقیق از نانوذرات سبز استفاده کنیم که احتمالاً نسبت به نانوذرات شیمیایی برای انسان و محیط زیست بسیار کمتر مضر و مقرون به صرفه هستند. نانوذرات اکسید فلز میتوانند وارد رگهای خونی و بافتهای مغز شوند و در نتیجه فراهمی زیستی را افزایش دهند. این ممکن است منجر به اثرات سمی و پاسخهای التهابی در مغز و تخریب سیستم عصبی مرکزی شود (21) مطالعات نشان داده است که نمک روی از طریق استنشاق، پوست و دستگاه گوارش وارد بدن میشود و میتواند باعث تهوع، مسمومیت، استفراغ و پوست و ریه شود(22). از طرفی، افزایش تشکیل ادم در بیماران سوختگی ممکن است منجر به آسیب سلولی، با آزاد شدن آنزیمهای کبدی شود. آنزیمهای کبدی مانند آسپارتات آمینوترانسفراز (AST) و آلانین آمینو ترانسفراز (ALT) حساس ترین شاخصهای آسیب سلولهای کبدی هستند.
آسیب سلولی یا تغییر در نفوذپذیری غشای سلولی، این آنزیمها را به گردش خون نشت می کند. سدیم کم و پتاسیم بالا به دلیل افزایش نفوذپذیری عروق و ادم سلولی رخ میدهد. این آنزیمها ممکن است نشانگرهای پیش بینی کننده پیش آگهی در بیماران سوختگی باشند. مطالعه MGHalaet al نشان میدهد که AST، ALT، ALP و گاما GT افزایش یافته است، به دلیل اختلال در عملکرد کبد در بیماران سوختگی (23). سوختگی منجر به افزایش تشکیل ادم میشود که به نوبه خود منجر به آسیب سلولی با آزاد شدن آنزیمهای کبدی میشود (24). مشاهده شده است که AST، ALT و ALP سرم در هفته اول پس از سوختگی به اوج خود رسیدند و به محدوده طبیعی 3-5 هفته پس از سوختگی نزدیک شدند. اگر آسیب کبدی ادامه یابد، آنزیمها بالا میمانند یا دوباره افزایش مییابند (23، 24). نشان داده شده است که کبد پس از یک آسیب حرارتی نقش مهمی ایفا میکند. افزایش در تشکیل ادم ممکن است منجر به آسیب سلولی با آزاد شدن آنزیمهای کبدی شود (22، 23). گزارشها نشان داد که AST و ALT افزایش یافته و به مدت 4 تا 6 هفته در سرم آزاد میشوند که نشان میدهد آسیب کبدی بلافاصله پس از سوختگی وجود دارد. سطح بیلی روبین سرم تنها به مدت 2 هفته پس از سوختگی افزایش یافت(27).
در سپسیس، کلستاز داخل کبدی اغلب بدون انسداد خارج کبدی قابل اثبات رخ میدهد. این پدیده در ارتباط با تعدادی از فرآیندها، مانند هیپوکسی، سمیت دارویی، یا تغذیه کامل تزریقی توصیف شده است (28). با توجه به خواص مفید نانوذرات سبز روی، جهت سنجش ایمن بودن این نانوذرات، لذا در مطالعهی حاضر بعد از مجاورت زخمها با دوز مشخصی از نانوذرات سبز روی، اثر این ذرات بر روی میزان آنزیمهای کبدی مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روش ها
سنتز نانوذرات روی با استفاده از برگ گیاه اکالیپتوس:
کلیه مراحل آزمایشگاهی با کد اخلاقی IR.IAU.NAJAFABAD.REC.1400.021 به تایید کمیته اخلاق دانشگاه آزاد اسلامی واحد نجف آباد رسیده است.
عصاره گیری
برای تهیه عصاره گیاه اکالیپتوس ملیودورا، برگهای گیاه اکالیپتوس در آذرماه1399 از مرکز جهاد کشاورزی استان اصفهان جمعآوری شد، سپس به روش جوشاندن استخراج شد و در نهایت عصاره گیاه از فیلترهای 4 میکرونی عبور داده شد. سپس محلول 1/0 مولار کلرید روی تهیه و به مدت 15 دقیقه روی صفحه داغ آهنربایی قرار گرفت. سپس محلول کلرید روی با عصاره بهدست آمده به نسبت 1:1 ترکیب شد و نانوذرات به مدت 15 دقیقه در دمای اتاق قرار گرفته شدند. حدود غلظتها از روی مقالات و بر اساس آزمون و خطا بر روی پیش آزمایش مشخص شدند. سپس محلول تولید شده سپس 6 بار شسته شده، سانتریفیوژ شده و روی صفحه قرار داده می شود و در دمای اتاق خشک می شود. در نهایت، از رسوب خشک شده به عنوان نانوذرات اکسید روی سبز به عنوان ماده پایه پماد استفاده میشود.
پراش پرتو ایکس (X-Ray Diffraction): محلول حاوی نانوذرات روی سه بار به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ شد(12000 دور در دقیقه) ، سپس مایع رویی
خارج شد و دور ریخته شد و رسوب در صفحه یا پلیت خشک شد. در نهایت پودر خشک شده برای نانوذرات کریستالی توسط XRD مورد بررسی قرار گرفت(این بررسی در دانشگاه اصفهان، دانشکده فیزیک مورد بررسی قرار گرفت). همچنین جهت بررسی خواص دقیق تر پودر نانوذرات حاصل، برای TEM به دانشگاه فردوسی مشهد ارسال گردید(29).
این مطالعه در آزمایشگاه تحقیقاتی دانشگاه آزاد اسلامی واحد فلاورجان انجام شد. در مجموع 42 سر رت نر از نژاد ویستار با وزن 180 تا 200 گرم از انستیتو پاستور ایران، پژوهشکده تهران خریداری و به لانه حیوانات دانشگاه منتقل شدند. پس از انتقال رتها به اتاق حیوانات، تراشه های چوبی کف قفس هر چند روز یکبار تعویض می شد و غذا و آب مصرفی نیز در همان مدت تعویض می شد. دمای اتاق نگهداری حدود 23 درجه سانتیگراد بود.
دوره 24 ساعته بر اساس 12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی بود. بنابراین، دما و نور در یک سطح ثابت قرار گرفتند. برای بیهوشی، از ترکیب کتامین (2 میلی گرم بر کیلوگرم) - زایلازین (3 میلی گرم بر کیلوگرم) استفاده شد و رت ها از شکم روی سطح میز قرار گرفتند و به آنها ماده ترکیبی بیهوشی تزریق شد و موهای پشت رت ها با کرم اصلاح برداشته شد. سپس با کمک هویه در مدت 30 ثانیه دمای آن به 100 درجه سانتی گراد رسید و سوختگی به قطر دو سانتیمتر در پشت موش ایجاد شد. هویه قبلاً به مدت 30 ثانیه گرم شده بود و به مدت 10ثانیه در پشت حیوان قرار داده شده بود( 30).
این مطالعه شامل هفت گروه بود:
1-گروه كنترل 1: بدون سوختگي و پماد روي آنها استفاده نشده است.
2- گروه کنترل 2: فقط سوختگی ایجاد شد.
3- گروه درمان با وازلین خالص: سوختگی ایجاد شد، وازلین خالص به مدت 21 روز بر روی سوختگی اعمال شد.
4- گروه درمان با پماد اکسید روی 25 درصد: سوختگی ایجاد شد و این پماد به مدت 21 روز به صورت موضعی در روز یک بار استفاده شد.
5_گروه درمان با پماد 1 درصد (حاوی پودر نانوذرات روی سبز + اوسرین): سوختگی ایجاد می شود و این پماد به مدت 21 روز یک بار در روز به صورت موضعی استفاده می شود(0.2gr پودر نانو + 24.8 gr اوسرین).
6_گروه درمانی با پماد 4% (حاوی اوسرین + پودر نانوذرات سبز روی سبز): سوختگی رخ داد و پماد به صورت موضعی یک بار در روز به مدت 21 روز استفاده شد(1gr پودر نانو + 24 gr اوسرین).
7_ گروه درمانی با پماد 16 درصد (حاوی اوسرین + نانوذرات سبز پودر روی) سوختگی رخ داد و پماد یک بار در روز به مدت 21 روز به صورت موضعی درمان شد( 4gr پودر نانو + 21 gr اوسرین).
طبق بررسی رفرنس های متعدد و جهت بررسی کوتاه مدت تاثیرات نانودرات سبز روی بر بهبود زخم های پوستی، درمان به مدت 21 روز متوالی تکرار شد و در روز بیست و دوم بیهوشی با کلروفرم انجام شد و سپس خونگیری از قلب رت ها انجام گرفت و سرم خون جهت تشخیص پارامترهای بیوشیمیایی استخراج شد (31).
جهت سنجش تاثیرات پماد حاوی نانوذرات سبز روی در روز 21 ام ، قطر سوختگی در گروههای مختلف اندازه گیری و با گروه شاهد مقایسه شد. برای اندازه گیری فعالیت آنزیم های ALT (آلانین آمینوترانسفراز)، ALP (آلکالین فسفاتاز) و AST (آسپارتات آمینوترانسفراز) پس از خونگیری، نمونه به مدت 1 ساعت در آزمایشگاه قرار داده شد. برای تهیه سرم، نمونه های خون با سرعت 3000 دور در دقیقه به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شدند (PRISM R، Labnet، ایالات متحده). سپس جداسازی سرم از لخته با استفاده از سمپلر (سمپلر متغیر و قابل اتوکلاو، برند، آلمان)انجام شد (32).
از تمام رتها در پایان روز بیست و دوم خونگیری از قلب انجام شد و سپس هر نمونه به مدت 15 دقیقه با سرعت3000دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس نمونهها در فریزر20- درجه سانتیگراد منجمد میشوند تا سنجش آنزیمی انجام شود. آنزیمهای کبدی شامل ALP، ALT و AST با استفاده از کیت های تست پارس آزمون در آزمایشگاه نوبل اصفهان بررسی شدند. نرمال بودن دادهها با استفاده از آزمون کولموگروف اسمیرنوف بررسی شد و دادهها نرمال بودند. سپس با استفاده از آزمونهای پارامتریک دادهها در سطح 05/0 آزمون فاکتوریل کاملا تصادفی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت و میانگین و انحراف معیار آزمون دانکن بررسی شد. دادهها با استفاده از نرم افزار SPSS21 تجزیه و تحلیل شد. مقایسه آماری بین گروههای دریافت کننده پماد نانوذرات سبز با درصد های 1%، 4% و 16% با گروه دریافت کننده پماد اکسید روی و گروه وازلین خالص و کنترل انجام شد. میانگین ها با حروف مشترک بر اساس آزمون دانکن در سطح 05/0 تفاوت معنی داری با یکدیگر نداشتند.
نتایج
تعیین نانوذرات اکسید روی
در این مطالعه، الگوی XRD نانوذرات اکسید روی سبز (simonkolleite) در شکل1 نشان داده شده است. این ذرات دارای خواص آنتی اکسیدانی بیشتری نسبت به نانوذرات اکسید روی خالص هستند.
اندازهگیری طیف سنجی ذرات simonkolleite و اکالیپتوس ملیدورا (Uv-vis):
در شکل 3 طیف جذب نانوذرات توسط اسپکتروفتومتر (Uv-visSERIES8000CECIL) انجام شده است. نرخ جذب simonkolleite در محدوده طول موج 279 نانومتر و محدوده طول موج عصاره اکالیپتوس 271 نانومتر مورد بررسی قرار گرفت(شکل 4).
شکل 1. الگوی XRD نانوذرات zno و simonkolleite zn5(OH)8CL2.H2O
میکروسکوپ الکترونی عبوری یا TEM
شکل2 ذرات simonkolleit را نشان می دهد. در این تصاویر اندازه نانوذرات حدود 45 نانومتر و ذرات شش ضلعی هستند.
تجزیه و تحلیل FTIR نانوذرات simonkolleite:
نانوذرات سبز سنتز شده از عصاره آبی برگهای اکالیپتوس به دلیل پیوند هیدروژنی به گروههای هیدروکسیل، اوج خود را در3452.92 cm-1 دارند. قله 2854.13 cm-1 آلدئیدها را نشان می دهد. قله 1620.88 cm-1 نیز گروه کربونیل را نشان می دهد. Peak 1044.26 cm-1 گروه آمینی برای ارتعاش کششی ناشی از ارتعاش کششی است. پیک 466.689 cm-1 مربوط به اکسید فلز و قله 2925.48 cm-1 مربوط به خمش متیلن است (شکل5).
شکل 2. تصویر TEM از نانوذرات اکسید روی
شکل 5. تجزیه و تحلیل FTIR نانوذرات simonkolleite
SGOT
مقایسه این عامل بین گروههای مورد مطالعه تفاوت محسوس و معنی داری را نشان نمیدهد (P-value = 0.169 = آنالیز واریانس). میانگین در گروه کنترل سالم بالاترین و در گروه پماد اکسید روی کمترین بود، اما این تفاوتها معنی دار نبود. در سطح 1% معنی دار نیست (شکل6).
شکل 6. فعالیت آنزیم SGOT در همه گروهها (05/0>p)
SGPT
مقایسه میانگین این عامل بین گروهها تفاوت معنی داری را نشان داد (P-value = 0.09 <0.09 = تجزیه و تحلیل واریانس). میانگین در گروه وازلین خالص کمترین و با دو گروه پماد اکسید روی و کنترل سالم که بالاترین میانگین را داشتند تفاوت معنیداری داشت. میانگین در سایر گروهها تقریباً مشابه بود و از نظر آماری تفاوتی نداشت. مقایسه میانگین SGPT در گروههای مختلف با آزمون ANOVA نشان داد که میانگین فعالیت SGPT در گروه کنترل سالم33/79±5/2 بود که در گروه وازلین خالص به 00/5±00/2 کاهش یافت و این کاهش از نظر آماری معنیدار بود (043/0 = P). همچنین میانگین فعالیت SGPT در گروه دریافت کننده پماد اکسید روی 23±84 بود که نسبت به وازلین خالص 00/5±00/2 افزایش معنیداری داشت. میانگین فعالیت این آنزیم در سایر گروهها تفاوت معنی داری نداشت (016/0 = P) (شکل 7).
شکل 7. فعالیت آنزیم SGPT در همه گروهها (05/0>p)
ALP
مقايسه ميانگين فعاليت اين عامل در بين گروههاي مورد مطالعه تفاوت معنيداري را نشان داد (05/0< 047/0 = P). اما مقدار احتمال مرزی است و پس آزمون توکی تفاوت معنی داری را نشان نداد. با توجه به آمار توصیفی می توان گفت که میانگین در گروه پماد 16 درصد کمترین میزان بوده و تنها با دو گروه کنترل سالم و وازلین خالص (بیشترین میانگین) تفاوت معنی داری وجود دارد. میانگین در سایر گروهها از نظر آماری معنی دار نبود (شکل 8).
شکل 8. فعالیت آنزیم SGPT در همه گروهها (05/0>p)
از آنجایی که قطر سوختگی در گروههای مختلف مقایسه گردیده است، نتایج به دست آمده از این تحقیق نشان می دهد که پماد 4 درصدی حاوی نانوذرات سبز روی تاثیرات ترمیم کننده بهتری در مقایسه با سایر غلظتهای تیمار در مقایسه با گروه کنترل می باشد. مقايسه ميانگين قطر زخم در بين گروههاي مورد مطالعه نشان داد میانگین قطر زخم در گروه شاهد سوختگی بر حسب میلی متر(8.64± 20 ) با گروه حاوی نانوذرات سبز روی ( 4.48± 20) تفاوت معنيداري را نشان داد (05/0>p).
بحث
از آنجایی که ارزیابی عملکرد کبد برای نتیجه پس از سوختگی یکی از فاکتورهای مهم جهت ایمن بودن پمادها و ترکیبات ضد سوختگی است، همچنین کاهش آسیب کبدی و ترمیم عملکرد کبد باعث بهبود عوارض و مرگ و میر بیماران سوختگی شدید میشود (33).بنابراین به دلیل اینکه در این مطالعه از نانو پمادها برای ترمیم زخم برای سه گروه استفاده شد، لذا در این تحقیق، به بررسی فعالیت آنزیمهای کبدی پرداخته شد. نتایج حاصل از تحقیق حاضر نشان دادند که نانوذرات به کار رفته در تمام دوزهای مختلف ایمن بوده و تاثیر معنی داری در میزان فعالیت آنزیم های کبدی نداشته اند (شکل 6، 7 و 8).
Jani و همکاران در سال 1990 نشان دادند که سمیت نانوذرات اکسید روی بر روی آنزیمهای کبدی در موشهای صحرایی نر با افزایش غلظت نانوذرات اکسید روی مرتبط بوده و در غلظت های بالا به بافت کبد آسیب میرساند و باعث افزایش سطح آنزیمهای کبدی در پلاسما میشود (34). با توجه به مطالعات انجام شده احتمالا از اواسط دوره که عوامل التهابی افزایش یافت، فعالیت آنزیمهای کبدی افزایش یافته( نتایجی که در کار ما دیده نشده)، اما پس از ترمیم ضایعات پوستی در روز 21 ام ، این التهابات فروکش کرده و متعاقباً فعالیت آنزیمهای کبدی به حالت عادی بازگشت. در مطالعه دیگری Chiang و همکاران در سال 2012 نشان دادند که تاثیرات نانوذرات اکسید روی و کلرید روی بر روی کبد و کلیه موشها باعث افزایش فعالیت پلاسمایی ترانس آمینازها و همچنین افزایش معنیدار محتوای روی در کبد و کلیه شده است. یعنی نانوذرات در این اندامها رسوب کرده اند و از طرفی به علت افزایش فعالیت ترانس آمینازها یه کبد آسیب رسانده اند. نتایج به دست آمده از تحقیق ما بر خلاف یافتههای محققین فوق بر ایمن بودن نانوذرات سبز حاوی روی بر آنزیمهای کبدی دارد احتمالا تفاوت در نحوه ساخت، قطر نانوذره و غلظت به کار رفته در تحیق ما در روز 21 دلیل عمده این تفاوت است (35). Wang و همکارانش در سال 2008 سمیت نانوذرات روی را به طور خوراکی از طریق گاواژ در موش بررسی کردند. در مقایسه با گروه کنترل، سلولهای طحال و مغز طبیعی بودند، در حالی که سایر اندامهای اصلی از جمله قلب، ریه ها، کبد و کلیهها از بین رفته بودند. دلیل ایمن بودن تحقیق ما در مقایسه با یافتههای محققین فوق، احتمالا متفاوت بودن نحوه تیمار موضعی در مقایسه با گاواژ می باشد (36).Cross و همکارانش در سال 2007 در مطالعه خود دریافتند که کاربرد موضعی نانوذرات روی با قطر 25-30 نانومتر باعث شفافیت پوست می شود. در آزمایشی که در طول درمان پوست سوخته انجام شد، تیرگی ناشی از سوختگی تا حد زیادی بهبود یافت. نتایج به دست آمده از تحقیقات محققین فوق در راستای نتایج مطالعه حاضر در غلظت 4 درصد(شکل 9) برای بهبود و ترمیم زخم های حاصل از سوختگی می باشد. (37). گیمر و همکارانش از نانو اکسید روی همراه با دی اکسید تیتانیوم برای ساخت کرم ضد آفتاب استفاده کردند، زیرا به راحتی توسط لایه شاخی پوست جذب می شود (38). پارک و همکارانش به این نتیجه رسیدند که نانوذرات روی با قطر 100 نانومتر دارای خواص سمی هستند، اما نانوذرات با قطر 20 نانومتر عملکرد خوبی برای درم دارندنتایج حاصل از این تحقیق در راستای نتایج به دست آمده از تحقیق ما بود که احتمالا مشابه بودن قطر نانوذرات (16 نانومتر) با تحقیق فوق، دلیل به دست آمدن نتایج مشابه است در مطالعه Park و همکاران در سال 2010، نتایج نشان داد سمیت نانوذرات روی توسط تیازولی بلو و تترازولیوم برومید تشخیص داده میشود که پوست تحت درمان با پماد نانوذرات اکسید روی دارای زخمهای کوچکتر و جای سوختگی بسیار کوچک است. نتایج به دست آمده از تحقیقات فوق در راستای گروه درمان با پماد 4 درصد، در مطالعه فوق می باشد. این نتایج به وضوح قابل مشاهده بود و از عمیق شدن زخم جلوگیری کرد(38).
تعارض منافع
نویسندگان مقاله تعرضی در منافع ندارند.
1. Nagati V, Koyyati R, Donda MR, Alwala J, Kundle KR, Padigya PR. Green Synthesis and characterization of Silver nanoparticles from Cajanus cajan leaf extract and its antibacterial activity. Int J Nanomater Biostruc. 2012; 2(3): 39-43.
2. Atta AM, Al-Lohedan HA, Ezzat AO. Synthesis of silver nanoparticles by green method stabilized to synthetic human stomach fluid. Molecules. 2014;19(5):6737-53.
3. Poovizhi J, Krishnaveni B. Synthesis, characterization and antimicrobial activity of zinc oxide nanoparticles synthesized from calotropis procera. Int J Pharmaceut Sci Drug Res. 2015; 7(5): 425-431.
4. Karimi J, Mohsenzadeh S. Plant synthesis of silver nanoparticles by Achilleawilhelmsii Pharmaceutical plant. Razi Journal of Medical Sciences. 2013; 20(111): 64-9.
5. Supraja S, Mohammed AS, Chakravarthy N, Jayaprakash PA, Elumalai S, Kalimuthu K, et al. Green synthesis of silver nanoparticles from Cynodon Dactylon leaf extract. Int J Chem Tech Res. 2013; 5(1):271-7.
6. Ramesh P, Rajendran A, Meenakshisundaram M. Green syntheis of zinc oxide nanoparticles using flower extract cassia auriculata. J NanoSci NanoTechnol. 2014; 2(1): 41-5.
7. Jamdagni P, Khatri P, Rana JS. Nanoparticles based DNA conjugates for detection of pathogenic microorganisms. Int Nano Lett. 2016; 6(3):139-46.
8. Ahmed S, Ahmad M, Swami BL, Ikram S. A review on plants extract mediated synthesis of silver nanoparticles for antimicrobial applications: a green expertise. J Adv Res. 2016; 7(1):17-28.
9. Handy RD, von der Kammer F, Lead JR, Hassellöv M, Owen R, Crane M. The ecotoxicology and chemistry of manufactured nanoparticles. Ecotoxicology. 2008;17(4):287-314.
10. Choi, O., Deng, K.K., Kim, N.J., Ross, N.J., Jr, L., Surampalli, R.Y., Hu, Z. The inhibitory effects of silver nanoparticles, silver ions, and silver chloride colloids on microbial growth, Water Res. (2008) 42, 3066–3074.
11. Christ-Crain M, Meier CPuder J, Staub J, Huber P ,Keller U. Changes in liver function correlate with the improvement of lipid profile after restoration of euthyroidism in patients with subclinical hypothyroidism. Excli J. 2004; 3: 9.
12. Panyam J, Labhasetwar V. Biodegradable nanoparticles for drug and genedelivery to cells and tissue. Adv Drug Deliv Rev. 2003; 55: 329-47.
13. Arora S, Jain J, Rajwade JM, Paknikar KM. Interactions of silver nanoparticles with primary mouse fibroblasts and liver cells. Toxicol Appl pharmacol, 2009; 236: 310-8.
14. Rastogi ID. Nanotechnology: safety paradigms J Toxi- col Environ Health. 2012; 4: 1-12.
15. Susan WP, Williw GM, Maaike VJ. Nanosilver- a review of avelable data and knowledge gaps in human and environmental risk assessment. Nanotoxicol. 2009; 3: 109-38.
16. Portney NG, Ozkan M. Nano-oncology: drug delivery, imaging, and sensing. Anal Bioanal Chem. 2006; 384: 620-30.
17. Hussain SM, Hess KL, Gearhart JM, Geiss KT, Schlager JJ. In vitro toxicity of nanoparticles in BRL 3A rat liver cells. Toxicol In Vitro 2005; 19: 975-83.
18. Heikal TM, Ghanem HZ. and Soliman, MS. Protective effect of green tea extracts against Dimethoate induced DNA damage.
and oxidant/antioxidant status in male rats. Biol Health Sci. Bulletin 2011; 3: 1-11.
19. Parivar K, Yaghmaie P, Hayati Roodbari N, Mohammadi Mohaghegh P. Effect of synchronized oral administration and topical application kombucha on third-degree burn wounds regeneration in
mature rats. Medical Sciences 2012; 22: 1-11.
20. Hala M. G., Mahfouz M. H. (2008). Biochemical Alterations Of Amino Acids, Neurotransmitters And Hepatic Functions After Thermal Injury In Rats. Egyptian Journal of Biochemistry and Molecular Biology 2008; 26 (2): 13-28.
21. Jeschke MG, Low JF, Spies M, et al. Cell proliferation, apoptosis, NF-kappaB expression, enzyme, protein, and weight changes in livers of burned rats. Am. J. hysiol.Gastrointest.Liver. Physiol 2001; 280: 1314–1320.
22. Jeschke MG, Low JF, Spies M, Vita R, Hawkins HK, Herndon DN, Barrow RE. Cell proliferation, apoptosis, NF-kappaB expression, enzyme, protein, andweight changes in livers of burned rats. Am. J. Physiol.Gastrointest.Liver.Physiol 2001; 280: G1314 -G1320.
23. Moshage H. Cytokines and the hepatic acute phase response. J.Pathol 1997; 181: 257-266.
24. Liao CC, Rossignol AM. Landmarks in burn prevention. Burns 2000; 26(5): 422-434.
25. Cano N, Gerolami A. Intrahepatic cholestasis during total parenteral nutrition. Lancet. 1983; 1: 985.
26. Burns Fact sheet N°365. WHO. April 2014. Archived from the original on 2015; 11: 10.
27. Wallace A. B.. The Treatment of Burns. Lord Horder. Oxford University Press 1941.
28. Moss DW, Henderson R. Clinical enzymology. In: Burtis CA‚ Ashwood ER. Eds. Tietz textbook of clinical chemistry 3th ed. Philadelphia:W.B Saunders Company 1999; 617-712.
29. Kwon JT, Hwang SK.. Minai-Tehrani A. Body distribution of inhaled fluorescent magnetic nanoparticles in the mice. J Occup Health 2008; 50; 1-6.
30. Batra N, Nehru B, Bansal MP. Influence of lead and zinc on rat male reproduction at biochemical and histopathological levels. J Appl Toxicol 2002; 1(6): 507-512.
31. Lockman PR, Oyewumi MO, Koziara JM, Roder KE, Mumper RJ, Allen DD. Brain uptake of thiamine-coated nanoparticles. J Control Release 2003; 93(3): 271-282.
32. Jani P, Halbert GW, Langridge J, Florence AT.. Pharm J. Pharmacol 1990; 42: 821-826.
33. Chiang HM, Xia Q, Zou X, Wang C, Wang S, Miller BJ, Howard PC, Yin JJ, Beland FA, Yu H, Fu PP. Nanoscale ZnO induces cytotoxicity and DNA damage in human cell lines and rat primary neuronal cells. J Nanosci Nanotechnol 2012; 12(3): 2126-2135.
34. Wang B, Feng W, Wang M, Wang T, Gu Y, Zhu M, Ouyang H, Shi J, Zhang F, Zhao Y. Acute toxicological impact of nano- and submicro-scaled zinc oxide powder on healthy adult mice. J Nanopart Res 2008;10: 263-276.
35. Joh DY, Kinder J, Herman LH, Ju S. Single-walled carbon nanotubes as excitonic optical wires. Nat Nanotecho 2011; l6: 51-56.
36. Cross SE, Innes B, Roberts MS, Tsuzuki T. Robertson TA, McCormick P. Human skin penetration of sunscreen nanoparticles: in-vitro assessment of a novel micronized zinc oxide formulation. Skin Pharmacol Physiol 2007; 20: 148-54.
37. Gamer A, Leibold E, van Ravenzwaay B. (2006). The in vitro absorption of microfine zinc oxideand titanium dioxide through porcin skin. Toxicol In Vitro (2006); 20: 301–307.
38. Park YH, Kim JN, Jeong SH, Choi JE, Lee SH, Choi BH, et al. Assessment of dermal toxicity of nanosilica using cultured keratinocytes, a human skin equivalent model and an in vivo model. Toxicology 2010; 267: 17.
Green synthesis of zinc nanoparticles and investigation of its changes on liver enzymes and its effect on wound healing caused by burns in laboratory Wistar male rats
Zahra Sinaee pour Fard1, Nooshin Naghsh2, Nasrin Yazdanpanahi3, Gholam Reza Amiri4
1- PhD student of Physiology, Department of Biology, Falavarjan Branch, Islamic Azad University, Isfahan, Iran.
2- Associate Professor, Department of Biology, Falavarjan Branch, Islamic Azad University, Isfahan, Iran. Corresponding author: n_naghsh@yahoo.com
3- Assistant Professor, Department of Biotechnology, Falavarjan Branch, Islamic Azad University, Isfahan,Iran
4- Associate Professor, Department of Physic, Falavarjan Branch, Islamic Azad University, Isfahan, Iran
Received:2022.08. 11 Accepted: 2022.10.31
Abstract
Introduction & Objective: Currently, zinc and its compounds are used as a suitable material for the treatment of infection in burns, open wounds and chronic wounds. This investigation, was designed and carried out with the aim the local effect of green zinc nanoparticles on blood biochemical parameters and skin tissue repair during wound healing in laboratory rat.
Materials and methods: In this experimental study, 42 male Wistar rats were divided into 7 groups of 6. Then, by creating a 2 cm burn on the back of the rats, treatment was immediately performed with zinc nanoparticles ointment (1%, 4%, 16%) and zinc oxide ointment and pure Vaseline for 21 days. After sampling from the percentage of wound repair in the skin of rats was calculated. Similarly, blood sampling was done from the hearts of rats and serum was used to check biochemical parameters.
Results: The percentage of wound healing in the 4% ointment group and zinc oxide ointment was significantly higher than the control group. In addition, all the concentrations of ointment were safe in terms of their effect on liver enzymes.
Conclution: The results of investigation showed that the ointment of 4% zinc nanoparticles was the best treatment group, which accelerated the repair of skin wounds. Based on the results of the present experimental study, probably the ointment produced by the identified green nanoparticles could be suggested as a strong repair agent in skin lesions naturally.
Key words: green zinc nanoparticles, wound repair, Liver enzymes.