Antibiotic resistance and presence of integron class 1 and class 2 genes amongst Escherichia coli isolates of urine specimens of inpatients and outpatients in Ahvaz, southern of Iran

Subject Areas : Bacteriology

Abbas Farahani ¹ (Department of Medical Laboratory Sciences, Khomein University of Medical Sciences, Khomein, Iran.)
Mahsa Dastranj ² (Student Research Committee, Ahvaz Jundishapur University of Medical Sciences, Ahvaz, Iran.)
Jebreil Shamseddin ³ (Infectious and Tropical Diseases Research Center, Hormozgan Health Institute, Hormozgan University of Medical Sciences, Bandar Abbas, Iran)
Hojat Veisi ⁴ (Student Research Committee, Ahvaz Jundishapur University of Medical Sciences, Ahvaz, Iran.)
Saber Soltani ⁵ (Department of Virology, School of Public Health, Tehran University of Medical Sciences, Tehran, Iran.)
Hadi Kalantar ⁶ (Department of Toxicology, School of Pharmacy, Ahvaz Jundishapur University of Medical Sciences, Ahvaz, Iran)

Received: 2023-06-12 Accepted : 2023-08-06 Published : 2023-11-16

Keywords: Escherichia coli, antibiotic resistance, Extended-Spectrum β-Lactamase, Integrons.,

Abstract :

Integrons play an essential role in spreading antibiotic resistance genes among Escherichia coli isolates. The aim of this study was to determine the prevalence of class 1 and 2 integrons amongst Escherichia coli isolates producing broad-spectrum beta-lactamases (ESBLs) in patients with urinary tract infections referred to Ahvaz teaching Hospital in 2017-2018. In this cross-sectional descriptive study, isolates were determined using conventional methods. Antibiotic susceptibility was measured by agar disc diffusion method. Production of ESBLs enzymes was measured via double disc method. Finally, presence of genes related to class 1 and 2 integrons was done using specific primers and Polymerase chain reaction method. Amongst 123 Escherichia coli ESBLs producing isolates the highest resistance was related to Cefotaxime, Ceftazidime, Cotrimoxazole and, Nalidixic acid, respectively, and the least resistance was related to Imipenem. About 84 (68.29%) isolates had multiple drug resistance (MDR). Additionally, 93 (75.60 %) isolates had class 1 integron and 11 (8.94 %) isolates had class 2 integron. There were no significant relationships between the presence of integrons and resistance to different antibiotics (p > 0.05). High prevalence of class 1 integron amongst Escherichia coli isolates producing broad-spectrum β-lactamase may contribute to resistance to common antibiotics. Therefore, identifying frequency of integrons and their relationship with drug resistance patterns seems to be necessary.

References:

References
Mohammadi-Mehr M, Feizabadi M. Antimicrobial resistance pattern of Gram-negative bacilli isolated from patients at ICUs of Army hospitals in Iran. Iranian journal of microbiology. 2011;3(1):26.
Alaee N, Bahador A, Harzandi N. Molecular epidemiology & antimicrobial resistance of Acinetobacter baumannii isolated from Namazi Hospital, in Shiraz by modified AFLP analysis. Journal of Microbial World. 2013;15(6):91-104.
FarajzadehSheikh A, Veisi H, Shahin M, Getso M, Farahani A. Frequency of quinolone resistance genes among extended-spectrum β-lactamase (ESBL)-producing Escherichia coli strains isolated from urinary tract infections. Tropical medicine and health. 2019;47:1-7.
Mohajeri P, Darfarin G, Farahani A. Genotyping of ESBL producing uropathogenic Escherichia coli in west of Iran. International journal of microbiology. 2014;2014.
golestani f, Javadpour S, Kafilzadeh F, daryaii z. Determination of antibiotic resistance pattern and frequency of blaVIM & blaIMP genes in clinical isolates of Acinetobacter species in Bandar Abbass. Journal of Microbial World. 2018;33(10):299-309.
Mohebi S, Hossieni Nave H, Norouzi A, Kandehkar Gharaman M, Taati Moghadam M. Detection of extended spectrum beta lactamases on class I integron in escherichia coli isolated from clinical samples. Journal of Mazandaran University of Medical Sciences. 2016;26(138):66-76.
Machado E, Cantón R, Baquero F, Galán J-C, Rollán A, Peixe L, Coque TM. Integron content of extended-spectrum-β-lactamase-producing Escherichia coli strains over 12 years in a single hospital in Madrid, Spain. Antimicrobial agents and chemotherapy. 2005;49(5):1823-9.
Ranjbar R, Farahani A. Shigella: antibiotic-resistance mechanisms and new horizons for treatment. Infect Drug Resist 12: 3137–3167. 2019.
Hosseini F, Salimizadeh Z, Salehi M. The evaluation of int1, sul1, aadA2, and aadB genes frequencies in clinical isolates of Acinetobacter baumannii in Tehran. Journal of Microbial World. 2017 Jan 1;9(4):297-306.
Mohajeri P, Rostami Z, Farahani A, Norozi B. Distribution of ESBL producing Uropathogenic Escherichia coli and carriage of selected [beta]-lactamase genes in Hospital and community isolates in west of Iran. Annals of Tropical Medicine and Public Health. 2014;7(5):219.
Nikokar I, Tishayar A, Flakiyan Z, Alijani K, Rehana-Banisaeed S, Hossinpour M, et al. Antibiotic resistance and frequency of class 1 integrons among Pseudomonas aeruginosa, isolated from burn patients in Guilan, Iran. Iranian journal of microbiology. 2013;5(1):36.
Moghaddam MJM, Mirbagheri AA, Salehi Z, Habibzade SM. Prevalence of class 1 integrons and extended spectrum beta lactamases among multi-drug resistant Escherichia coli isolates from north of Iran. Iranian biomedical journal. 2015;19(4):233.
Yan H, Li L, Zong M, Alam MJ, Shinoda S, Shi L. Occurrence and characteristics of Class 1 and 2 integrons in clinical bacterial isolates from patients in south China. Journal of health science. 2010;56(4):442-50.
Wayne P. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing: Twenty seven Informational Supplement M100-S27CLSI. 2021.
Mobasseri P, Harsini MJ, Mehrabian S, Amini K. Detection of Different Types of Class 1, 2 and 3 Integrons among Pseudomonas aeruginosa Isolates from Raw Milks. Journal of Medical Bacteriology. 2021:11-8.
Hajiahmadi F, Safari N, Alijani P, Rabiei M, Masomian N, Arabestani MR. Assessment of the Prevalence of Class I and II Integrons of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae Isolates From Hospitals of Hamadan. Avicenna Journal of Clinical Medicine. 2016;23(3):193-201.
Shaheli M, Baseri Salehi M, Bahador N. Antibiotic resistance dependent on efflux pump in the isolates of clinical and environmental Acinetobacter baumannii. Journal of Microbial World. 2019 May 22;12(1):15-26.
Zeighami H, Haghi F, Hajiahmadi F. Integrons and Their role in Antibiotic Resistance. Laboratory & Diagnosis. 2014;5(22):61-71.
Vaziri S, Abiri R, Mansouri F, Alvandi A, Azizi M, Hasanvand B, et al. The Molecular Investigation of Class 1 and 2 Integrons among the Escherichia Coli Isolated from Urine Samples of Children in Imam Reza Hospital, Kermanshah City, Iran, in 2016. Journal of Isfahan Medical School. 2017;35(446):1171-7.
Kargar M, Mohammadalipour Z, Doosti A, Lorzadeh S, Japoni-Nejad A. High prevalence of class 1 to 3 integrons among multidrug-resistant diarrheagenic Escherichia coli in southwest of Iran. Osong public health and research perspectives. 2014;5(4):193-8.
Barzegar S, Arzanlou M, Teimourpour A, Esmaelizad M, Yousefipour M, MohammadShahi J, Teimourpour R. Prevalence of the Integrons and ESBL Genes in Multidrug-Resistant Strains of Escherichia coli Isolated from Urinary Tract Infections, Ardabil, Iran. Iranian Journal of Medical Microbiology. 2022;16(1):56-65.
Rezaee MA, Sheikhalizadeh V, Hasani A. Detection of integrons among multi-drug resistant (MDR) Escherichia coli strains isolated from clinical specimens in northern west of Iran. Brazilian Journal of Microbiology. 2011;42:1308-13.
Li W, Ma J, Sun X, Liu M, Wang H. Antimicrobial Resistance and Molecular Characterization of Gene Cassettes from Class 1 Integrons in Escherichia coli Strains. Microbial Drug Resistance. 2022;28(4):413-8.
Yekani M, Memar MY, Baghi HB, Sefidan FY, Alizadeh N, Ghotaslou R. Association of integrons with multidrug-resistant isolates among phylogenic groups of uropathogenic Escherichia coli. Microbiology Research. 2018;9(1):7484.
Fallah F, Karimi A, Goudarzi M, Shiva F, Navidinia M, Hadipour Jahromi M, Sajadi Nia RS. Determination of integron frequency by a polymerase chain reaction–restriction fragment length polymorphism method in multidrug-resistant Escherichia coli, which causes Urinary tract infections. Microbial Drug Resistance. 2012;18(6):546-9.
Behera M, Roshan M, Rajput S, Gautam D, Vats A, Ghorai SM, De S. Novel aadA5 and dfrA17 variants of class 1 integron in multidrug-resistant Escherichia coli causing bovine mastitis. Applied Microbiology and Biotechnology. 2023;107(1):433-46.
Al-Hasani HM, Al-Rubaye DS, Abdelhameed A. The Emergence of Multidrug-Resistant (MDR), Extensively Drug-Resistant (XDR), and Pandrug-Resistant (PDR) In Iraqi Clinical Isolates of Escherichia coli. Journal of Population Therapeutics and Clinical Pharmacology. 2023;30(5):469-82.
Rao AN, Barlow M, Clark LA, Boring JR, Tenover FC, McGowan JE. Class 1 integrons in resistant Escherichia coli and Klebsiella spp., US hospitals. 2006.
Jouini A, Klibi A, Kmiha S, Hamrouni S, Ghram A, Maaroufi A. Lineages, Virulence Gene Associated and Integrons among Extended Spectrum β-Lactamase (ESBL) and CMY-2 Producing Enterobacteriaceae from Bovine Mastitis, in Tunisia. Pathogens. 2022;11(8):948.

Full-Text:



 

مقاومت آنتی بیوتیکی و حضور ژن های اينتگرون كلاس  1 و 2 در ميان جدایه هاي اشریشيا كلي جدا شده از نمونه های ادرار بیماران بستری و سرپایی شهر اهواز، جنوب ایران

اینتگرون ها نقش اساسی در انتشار ژن های مقاومت آنتی بیوتیکی در بین جدایه های اشريشيا كلي دارند. هدف از این مطالعه، تعیین شیوع اینتگرون های کلاس 1 و 2 در میان جدایه های اشريشيا كلي مولد بتالاکتامازهای وسیع الطیف (ESBLs) جدا شده از بیماران مبتلا به عفونت های دستگاه ادراری مراجعه کننده به بیمارستان آموزشی اهواز در سال 1394-95 بود.

در این مطالعه توصیفی- مقطعی، جدایه ها با استفاده از روش های مرسوم آزمایشگاهی شناسایی شدند. حساسیت آنتی بیوتیکی جدایه ها بوسیله روش دیسک دیفیوژن آگار و تولید آنزیم های ESBLs با استفاده از روش Double disc مورد سنجش قرار گرفت. در نهایت حضور ژن های مربوط به اينتگرون هاي كلاس 1 و 2 با  استفاده از روش PCR  انجام شد. در بین 123 جدایه اشریشیا کلی تولید کننده ESBLs، بيشترين ميزان مقاومت آنتي بيوتيكي به ترتیب نسـبت بـه سفوتاکسیم، سفتازدیدیم ، کوتریموکسازول، نالیدیکسیک اسید و كمتــرين مقاومــت آنهــا نســبت بــه ايمــي پــنم مشاهده شد.

تعداد 84 (29/68 درصد) جدایه دارای مقاومت دارویی چند گانه (MDR) بودند. تعداد 93 (60/75 درصد) جدایه دارای اینتگرون کلاس 1 و 11 (94/8 درصد) جدایه دارای اینتگرون کلاس 2 بودند. ارتباط معنی داری بین حضور اینتگرون و مقاومت به آنتی بیوتیک های مختلف مشاهده نشد (P > 0/05). شیوع بالای اینتگرون کلاس 1 در بین جدایه های اشريشيا كلي مولد بتالاکتاماز وسیع الطیف ممکن است به مقاومت به آنتی بیوتیک های رایج، کمک کند. بنابراین بررسی فراوانی اینتگرون ها و ارتباط آنها با الگوهای مقاومت آنتی بیوتیکی ضروری بنظر می رسد.

واژگان کلیدی: اشريشيا كلي، مقاومت آنتی بیوتیکی، بتالاکتاماز های وسیع الطیف، اینتگرون 

 

 

 

 

Antibiotic resistance and presence of integron class 1 and class 2 genes amongst Escherichia coli isolates of urine specimens of inpatients and outpatients in Ahvaz, southern of Iran

Abstract

Integrons play an essential role in spreading antibiotic resistance genes among Escherichia coli isolates. The aim of this study was to determine the prevalence of class 1 and 2 integrons amongst Escherichia coli isolates producing broad-spectrum beta-lactamases (ESBLs) in patients with urinary tract infections referred to Ahvaz teaching Hospital in 2015-2016. In this cross-sectional descriptive study, isolates were determined using conventional methods. Antibiotic susceptibility was measured by agar disc diffusion method. Production of ESBLs enzymes was measured via double disc method. Finally, presence of genes related to class 1 and 2 integrons was done using specific primers and Polymerase chain reaction method. Amongst 123 (60%) Escherichia coli ESBLs producing isolates the highest resistance was related to Cefotaxime, Ceftazidime,  Cotrimoxazole and, Nalidixic acid, respectively, and the least resistance was related to Imipenem. About 84 (68.29%) isolates had multiple drug resistance (MDR). Additionally, 93 (75.60 %) isolates had class 1 integron and 11 (8.94 %) isolates had class 2 integron. There were no significant relationships between the presence of integrons and resistance to different antibiotics (p > 0.05). High prevalence of class 1 integron amongst Escherichia coli isolates producing broad-spectrum β-lactamase may contribute to resistance to common antibiotics. Therefore, identifying frequency of integrons and their relationship with drug resistance patterns seems to be necessary.

Keywords: Escherichia coli, antibiotic resistance, Extended-Spectrum β-Lactamase, Integrons.

 

 

 

 

مقدمه

اشريشيا كلي به عنوان یکی از اعضای خانواده انتروباکتریاسه، از گروه باسیل های گرم منفی بی هوازی اختیاری می باشند. این باکتری از عوامل مهم ایجاد کننده عفونت های بیمارستانی خصوصا  در  بخش مراقبت‌های ویژه به شمار می رود (1). این میکروارگانیسم از شایع ترین علت ایجاد عفونت های مجاری ادراری و همچنین یک پاتوژن مهم در مننژیت نوزادان و عفونت های تنفسی و سپسیس در بیماران بستری در بخش های مختلف بیمارستان بویژه بخش مراقبت های ویژه می باشد. مقاومت آنتی بیوتیکی در بین سویه های اشريشيا كلي بسیار شایع است و این به سبب کسب فاکتورهای مقاومت متعدد می باشد (2, 3). بتالاکتامازهای وسیع الطیف (ESBLs) گروهی از آنزیم‌ها هستند که در بین انتروباکتریاسه‌ها رایج هستند. بتالاکتامازهای وسیع الطیف توانایی هیدرولیز نسل سوم و چهارم سفالوسپورین ها و مونوباکتام ها را دارند. اگر چه ESBL ها توصیف شده در طیف وسیعی از انتروباکتریاسه ها از نقاط مختلف دنیا گزارش شده اند، اما آنها اغلب در اشريشيا كلي و کلبسیلا پنومونیه شناسایی شده اند (4).  

درمان عفونت های ناشی از جدایه های باکتریایی مولد بتالاکتامازهای وسیع الطیف بسیار مشکل می باشد، زیرا از یک طرف باعث مقاومت به طیف وسیعی از سفالوسپورین ها می شوند و از طرفی دیگر بسیاری از ژن های ESBL بر روی پلاسمید های بزرگی قرار دارند، که همزمان سایر ژن های مقاومت میکروبی مثل کلرامفنیکل، سولفونامیدها، آمینوگلیکوزید ها و تتراسایکلین ها نیز وجود دارند. بیشتر ژن های مربوط به ESBL ها که اخیرا طی مطالعاتی شناسایی شده اند، به طور مکرر در ساختارهایی مانند اینتگرون ها یافت شده اند. بنابراین ژن های مقاومت آنتی بیوتیکی از جمله ESBL ها می توانند بر روی اینتگرون ها قرار گیرند و به راحتی توسط این ساختارهای ژنتیکی گسترش یابند (5, 6). 

انتقال افقی ژن (Horizontal gene transfer) یکی از مکانیسم های اصلی مقاومت آنتی بیوتیکی و پاتوژنز در میکروارگانیسم ها می باشد (7). اینتگرون ها شامل یک سیستم کسب ژنی خاصی هستند که با یک مکانیسم منحصر به فردی، توانایی ورود به سلول جدید، و نیز بیان کاست های ژنی خود را دارند. این سیستم برروی عناصر ژنتیکی متحرک قرار داشته و پتانسیل زیادی برای انتقال ژن های مقاومت به آنتی بیوتیک ها را دارا می باشند (6, 8). اينتگرون هاي كد كننده مقاومت در برابر آنتي بيوتيك ها را مي توان به چهار كلاس تقـسيم كـرد كه هر كلاس واجـد اينتگـراز خـاص خـود اسـت.

اینتگرون کلاس 1 شایع ترین اینتگرون از لحاظ انتشار در گونه های بالینی می باشد به طوری که در 22 تا 59 درصد از گونه های گرم منفی گزارش شده اند. كــلاس  2 اينتگــرون هــا در ترانسپوزون هاي Tn-7  قرار دارند. اینتگرون ها با وجود داشتن سیستم کسب کاست های ژنی مقاومت به آنتی بیوتیک که در مکان attI و با کمک آنزیم اینتگراز (IntI) وارد می گردد،  می توانند موجب توسعه مقاومت به آنتی بیوتیک های مختلف شوند (6). اهميت کلنيکي اينتگرون ها در اين است که مصرف بي رويه يک آنتي بيوتيک (مانندآنتي بيوتيک هاي بتالاکتام) در محيطي همچون بيمارستان، موجب فشار انتخاب طبيعي و حاکم شدن سويه هاي مقاوم به آنتي بيوتيک مي شوند (9, 10).

با توجه به مطالب بیان شده، مطالعات اپیدمیولوژیکی در خصوص فراوانی ايزوله هاي اشريشيا كلي مقاوم به آنتی بیوتیک حامل اینتگرون برای کنترل عفونت ضروری به نظر می رسد. بنابراین هدف از این مطالعه، تعیین شیوع اینتگرون های کلاس 1 و 2 در میان جدایه های اشريشيا كلي مولد بتالاکتامازهای وسیع الطیف (ESBLs) جدا شده از بیماران بستری و سرپایی مبتلا به عفونت های دستگاه ادراری مراجعه کننده به بیمارستان گلستان اهواز در سال 1394 بود.

مواد و روش ها

در این مطالعه توصیفی- مقطعی که طی دی ماه 94 لغایت مهر ماه 1395 انجام شد، نمونه های اشريشيا كلي جمع آوری شده از بیماران بستری و سرپایی بیمارستان آموزشی اهواز مورد بررسی قرار گرفتند. تعداد کل نمونه های جمع آوری شده اشريشيا كلي، 205 جدایه بود.  نمونه هایی که بر اساس سرشماری جمع آوری شده اند، پس از تعیین جنس و گونه،  با استفاده از روش های مرسوم آزمایشگاهی (تست های بیوشیمیایی) و تائید در موارد لازم به کمک کیت API20E ، در فریزر 80- درجه سانتیگراد تا زمان انجام بررسی مولکولار ژن های دخیل در مقاومت ذخیره شدند.

 تست تعیین حساسیت آنتی بیوتیکی

در اين بررسي حساسيت آنتي بيوتيكي مربوط به جدایه های اشریشيا كلي مولد بتالاکتامازهای وسیع الطیف (ESBL) به روش انتشار از ديسك در مولر هینتون  آگار (روش كربي بائر) و طبق معیارهای دستورالعمل-2018  CLSI (Clinical and laboratory standard institute) انجام شد (11). از 9  آنتی بیوتیک مختلف شرکت MAST شامل ایمی پنم (µg 10)، نالیدیکسیک اسید (µg 30)، سیپروفلوکساسین (µg 5)، افلوکساسین (µg 5)، سفتازیدیم (µg 30)، سفوتاکسیم (µg 30)، جنتامایسین (µg 10)، کوتریموکسازول (µg 23.75/1.25)، و کلرامفنیکل (µg 30) جهت آنتی بیوگرام استفاده گردید. از سویه استاندارد اشريشيا كلي ATCC 25922 برای کنترل کیفی محیط های کشت و آنتی بیوگرام استفاده شد. همچنین جدایه هایی که حداقل به سه کلاس آنتی بیوتیکی مقاوم بودند را به عنوان جدایه های مقاوم به چند دارو (multidrug-resistant) در نظر گرفته شدند.

تعیین ارگانیسم های مولد بتالاکتامازهای وسیع الطیف (ESBLs)

 غربالگري ارگانيسم هاي مولد ESBL با استفاده از روش DDST (double-disk synergy test) صورت گرفت. در اين روش ابتدا سوسپانسيوني از باكتري با كدورت نيم مك فارلند تهيه شد و به وسيله سواپ استريل به روي محيط مولر هينتون آگار (40/7-20/7 pH) كشت داده شد. سپس از دیسک های ترکیبی سفتازیدیم/ کلاولانیک اسید (μg 30 + μg 10) در مقایسه با سفتازیدیم (μg 30) و سفوتاکسیم/ کلاولانیک اسید (μg 30 + μg 10) در مقایسه با سفوتاکسیم (μg 30) که از شرکت MAST انگلستان خریداری شده بودند، استفاده شد. بعد از انکوباسیون به مدت 24 ساعت در 37 درجه سانتی گراد، قطر هاله عدم رشد مورد بررسی قرار گرفت. افزايش بيش از 5 ميلي متر در قطر هاله هر كدام از آنتي بيوتيك هاي فوق در تركيب با كلاولانيك اسيد نسبت به آنتي بيوتيك تنها نشانه توليد ESBL توسط باكتري خواهد بود (4) . از سویه استاندارد کلبسیلا نومونیه ATCC 700603 برای کنترل کیفی استفاده شد. 

 

استخراج DNA  و انجام PCR

 در اين پژوهش از دستورالعمل استخراج DNA به روش جوشاندن (Boiling) استفاده شد. جدایه ها بر روي پليت مکانکي آگار (Merck, Germany) کشت و در دماي 37 درجه به مدت 24-18 ساعت در انکوباتور قرار گرفتند. سپس يک لوپ از منطقه اول کشت برداشته و در 250 ميکروليتر آب مقطر تزريقي استريل حل شد. سوسپانسيون باکتري به مدت 10 دقيقه در دماي 90 درجه سانتي گراد (در بن ماري 90 درجه) انکوبه شد. سوسپانسيون به مدت 5 دقيقه با 12000 دور سانتريفيوژ شد. محلول بالايي که حاوي DNA است به يک ميکروتيوب خالي انتقال داده شد.

 واكنشPCR  جهــت شناســايي ژن هــاي اينتگــرون كــلاس  1 و كــلاس  2 بــا اســتفاده از پرايمرهاي اختصاصي که در جدول 1 ذکر گردیده و با حجم نهايي 25 ميكروليتـر که شـامل 50/12 ميكروليتر مسترمیکس، 1 ميكروليتر از هر كـدام از پرايمر مورد نظر، 3 ميكروليتر  DNA باكتري و در نهایت با آب مقطر استريل تا حجم 25ميكروليتر رسانیده شد، انجام گرفت (12). 

 جدول 1. توالی پرایمرها و محل قرار گیری ژن ها بر روی ژل آگارز

ژن	توالی پرایمر	طول قطعه (bp)	منبع
Intl 1	F: 5′- CAGTGGACATAAGCCTGTTC -3′	160	(12)
	R: 5′- CCCGAGGCATAGACTGTA-3′
Intl 2	F: 5′- GTAGCAAACGAGTGACGAAATG-3′	789
	R: 5′- CACGGATATGCGACAAAAAGGT-3′

 

 

 

 

آنالیز اطلاعات

داده های بدست آمده توسط نرم افزار SPSS نسخه 22 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. از آزمون آماری Chi-Square جهت مقایسه مقاومت آنتی بیوتیکی و حضور اینتگرون ها در  جدایه های اشریشیا کلی بدست آمده از بیماران سرپایی و بستری، استفاده گردید و P value کمتر از 05/0 به عنوان با معنی بودن آزمون در نظر گرفته شد.

یافته ها

در این مطالعه 205 ایزوله باکتریایی به واسطه انجام تست های بیوشیمیایی تائیدی به عنوان اشريشيا كلي شناسایی شدند. تعداد 123 جدایه تولید کننده بتالاکتاماز وسیع الطیف بودند، که به عنوان جمعیت مورد بررسی در این مطالعه قرار گرفتند. همچنین از مجموع 123 (60 درصد) جدایه تولید کننده بتالاکتاماز وسیع الطیف، 58 (15/47 درصد) جدایه مربوط به بیماران بستری و  65 (85/52 درصد) جدایه مربوط به بیماران سرپایی بودند (شکل شماره 1).

 

شکل 1: فراوانی جدایه های مربوط به بیماران سرپایی، بستری، جدایه های تولید کننده بتالاکتاماز وسیع الطیف  (ESBL) و مقاوم به چند دارو (MDR).

 به طور کلی در این میان 36 نمونه از مردان (27/29 درصد)  و 87  نمونه از زنان (73/70 درصد) جدا گردید که محدوه سنی مراجعه کنندگان در جدول شماره 1 نشان داده شده است.

 

شکل 2. فراوانی جدایه های مورد بررسی بر اساس رده سنی  افراد مراجعه کننده جهت جداسازی باکتری های اشريشيا كلي از ادرار

بيشترين ميزان مقاومت آنتي بيوتيكي جدایه هـا به ترتیب نسـبت بـه سفوتاکسیم (06/91درصد)، سفتازدیدیم (24/90 درصد)، کوتریموکسازول (49/80 درصد)، نالیدیکسیک اسید (49/80 درصد)، سیپروفلوکساسین (29/68 درصد) و افلوکساسین (67/66 درصد) و كمتــرين مقاومــت آنهــا نســبت بــه ايمــي پــنم (76/9 درصد) مشاهده شد (جدول 3). بررسی فراوانی اینتگرون های کلاس 1 و کلاس 2 نشان داد که  93 جدایه (60/75 درصد) دارای اینتگرون کلاس 1 و 11 جدایه (94/8 درصد) دارای اینتگرون کلاس 2 بودند.

ارتباط معنی داری بین حضور اینتگرون و مقاومت به آنتی بیوتیک های متعدد مشاهده نشد (P > 0/05). در بین 123 جدایه تولید کننده بتالاکتاماز وسیع الطیف جمع آوری شده، تعداد 84 جدایه (29/68 درصد) دارای مقاومت چندگانه دارویی (MDR) بودند.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

جدول 3. مقاومت هاي آنتي بيوتيكي در ايزوله های اشريشيا كلي مولد بتالاکتاماز وسیع الطیف و فراوانی اينتگرون ها در جدایه های مقاوم به آنتی بیوتیک ها

آنتی بیوتیک	حساس ]تعداد (درصد) [	نیمه حساس ]تعداد (درصد) [	مقاوم ]تعداد (درصد) [	مقاومت اينتگرون كلاس 1 ]تعداد (درصد) [	مقاومت اينتگرون كلاس 2 ]تعداد (درصد) [
ایمی پنم	109 (62/88)	2 (63/1)	12 (76/9)	11 (67/91)	3 (25)
افلوکساسین	40 (52/32)	1 (81/0)	82 (67/66)	65 (26/79)	7 (54/8)
سیپروفلوکساسین	29 (58/23)	10(13/8)	84 (29/68)	70 (33/83)	8 (52/9)
نالیدیکسیک اسید	21 (07/17)	3 (44/2)	99 (49/80)	75 (76/75)	10 (10/10)
سفوتاکسیم	3 (44/2)	8 (50/6)	112 (06/91)	82 (21/73)	11 (41/13)
سفتازیدیم	2 (66/1)	10 (13/8)	111 (24/90)	79 (17/71)	9 (11/8)
جنتامایسین	73 (35/59)	0 (0)	50 (65/40)	37 (74)	7 (54/8)
کوتریموکسازول	18 (63/14)	6 (88/4)	99 (49/80)	76 (77/76)	9 (11/8)
کلرامفنیکل	69 (10/56)	23 (70/18)	31 (20/25)	21 (74/67)	4 (90/12)

 

 

بحث

جدایه های اشريشيا كلي یکی از عوامل بیماریزای شناخته شده می باشد، که نه تنها در افراد دچار نقص سیستم ایمنی، بلکه حتی در افراد سالم نیز می تواند منجر به ایجاد عفونت های شدید و حاد گردد (3). افزایش چشمگیر و روز افزون مقاومت نسبت به انواعی از آنتی بیوتیک ها، اهمیت بررسی الگوی مقاومت در این جدایه ها را محرز کرده تا به این ترتیب امکان انتخاب داروهای درمانی با کارایی و موفقیت بیشتر میسر گردد (13). در سال های اخیر نقش اینتگرون ها به عنوان یکی از عناصر دخیل در انتقال افقی مقاومت آنتی بیوتیکی مشخص گردیده است. از انجایی که بسیاری از آنها دارای بیش از یک کاست ژنی مقاومتی هستند و اغلب نیز توسط المنت های ژنتیکی متحرک جا به جا و حمل می شوند و از این طریق منجر به گسترش مقاومت میکروبی از یک سویه به سویه دیگر می شوند (14). مطالعه حاضر بر روی 123 جدایه اشريشيا كلي مولد بتالاکتاماز وسیع الطیف  جدا شده از بیمارستان آموزشی اهواز انجام گرفت. طبق نتایج این مطالعه، مقاومت بالایی نسبت به آنتی بیوتیک های سفوتاکسیم (06/91درصد)، سفتازدیدیم (24/90 درصد)، کوتریموکسازول (49/80 درصد)، نالیدیکسیک اسید (49/80 درصد)، سیپروفلوکساسین (29/68 درصد) و افلوکساسین (67/66 درصد) گزارش شد. همچنین كمتــرين مقاومــت نســبت بــه ايمــي پــنم (76/9 درصد) مشاهده شد که این آنتی بیوتیک موثرترین آنتی بیوتیک بر ضد جدایه های اشريشيا كلي در مطالعه حاضر می باشد.

نتایج به دست آمده در این تحقیق موید این امر است که درصد قابل توجهی از نمونه های مورد بررسی در این مطالعه مولد بتالاکتاماز وسیع الطیف (ESBL) هستند و همچنین مقاومت به آنتی بیوتیک های رایج در این نمونه ها به شدت رو به افزایش است، که به نظر می رسد این افزایش مقاومت و شیوع ارگانیسم های تولید کننده ESBL می تواند به دلیل مصرف بیش از حد سفالوسپورین ها باشد. همچنین افزایش مقاومت در جامعه می تواند به دلیل خود درمانی افراد با آنتی بیوتیک های مختلف یا حتی استفاده از نسخه های افراد دیگر با بیماری های مشابه بدون توجه به الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی باشد، که مسئله عدم توجه به حساسیت آنتی بیوتیکی نقش اساسی را در افزایش مقاومت به عهده دارد.

در مطالعه ای که در سال 2016 توسط محبی و همکاران در کرمان انجام شد، بیشترین مقاومت به آنتی بیوتیک های آمپی سیلین، نالیدیکسیک اسید، کوتریموکسازول و سفتریاکسون مشاهده شد و نیز کمترین میزان مقاومت مربوط به آنتی بیوتیک های ایمی پنم و آمیکاسین بود (4). که نتایج مطالعه حال حاضر با نتایج آنها هم خوانی دارد. در مطالعه ای که توسط وزیری و همکاران انجام شد، این محققین نیز بیشترین مقاومت را نسبت به آنتی بیوتیک های آمپي سيلين و كوتريموكسازول و بیشترین حساسیت را نسبت به آنتی بیوتیک ایمی پنم گزارش کردند که این نتایج مشابه با نتایج مطالعه حاضر بود (15).

در مطالعات مختلف، درصد فراوانی جدایه های اشريشيا كلي مقاوم به چند دارو (MDR) از حدود 42 درصد تا 88 درصد گزارش شده است (16, 17). در مطالعه حاضر، فراوانی جدایه های مقاوم به چند دارو در میان جدایه های مولد ESBLs ،تعداد 84 جدایه (29/68 درصد) بود. این آمار نشان می دهد که جدایه های اشریشیا کلی مولد ESBLs احتمالا حاوی سایر ژن های مقاومتی نیز می باشند. 

در مطالعه ای که توسط رضایی و همکاران در سال 2011 میلادی در شهر تبریز انجام شد، 20/84 درصد از جدایه های اشريشيا كلي مقاوم به چند دارو یا MDR بودند که این میزان فراوانی جدایه های MDR بیشتر از نتایج بدست آمده در این مطالعه می باشد و نشان دهنده تفاوت در فراوانی این جدایه ها در نقاط مختلف جغرافیایی می باشد (18).

از جمله دلايل تفاوت در نتايج مقاومت هاي دارويي گزارش شده در مطالعـات مختلف، مي توان به عـواملي همچـون تفـاوت در نوع آنتي بيوتيك هاي مورد استفاده، الگوهـاي مصـرف داورها، و تفـاوت هـاي جغرافيـايي اشاره نمود (3, 16).

تا به امروز، اینتگرون های مرتبط با عناصر ژنتیکی متحرک به پنج کلاس بر اساس توالی اینتگراز (کلاس های 1 تا 5) طبقه بندی شده اند. اینتگرون‌های کلاس 1 با گرفتن کاست‌های ژنی و بیان ژن‌های ذخیره‌شده در کاست که باکتری‌ها را قادر می‌سازد تا با تغییرات محیطی سازگار شوند، به‌عنوان پلتفرم‌های تکاملی برای باکتری‌ها عمل می‌کنند، که امکان انتقال افقی ژن های مقاومت چند دارویی را فراهم می کند (19).

 

طبق نتایج این مطالعه، فراوانی اینتگرون های کلاس 1 و کلاس 2 بترتیب 93 جدایه (60/75 درصد)   و 11 جدایه (94/8 درصد) بودند. مطالعات مختلفی در کشور ما در خصوص فراوانی اینتگرون ها در جدایه های اشريشيا كلي جدا شده از نمونه های  بالینی انجام شده است (17, 20). مطابق با مطالعات قبلی، اینتگرون‌های کلاس 1 در مقایسه با کلاس 2 در مطالعه ما رایج‌تر بود.  مشابه نتایج ما، در مطالعه ای که توسط یکانی و همکاران که در ایران انجام شد، بیشترین فراوانی مربوط به  اینتگرون های کلاس1 (60/63 درصد) بود (20).  در یک مطالعه دیگر از ایران که توسط فلاح و همکاران در سال 2012 انجام شد، 30/50 درصد از جدایه های اشريشيا كلي برای اینتگرون های کلاس 1 مثبت بودند (21)، که نسبت به مطالعه ما کمتر بود. با توجه به مطاله ما و سایر مطالعات انجام شده در خصوص شناسایی اینتگرون ها، بنظر می رسد که اینتگرون کلاس 1 در میان جدایه های اشریشیا کلی جدا شده از بیماران، در کشور ما غالب باشد.

کارگر و همکاران در مطالعه ای از ایران گزارش داده اند که میزان شیوع اینتگرون کلاس 1 و 2 به ترتیب 70/41 و 40/17 درصد است (16). که فراوانی اینتگرون کلاس 1 کمتر در حالی که فراوانی اینتگرون کلاس دو بیشتر از مطالعه ما بود.

در مطالعه برزگر و همکاران، نتایج آزمایش PCR نشان داد که شیوع اینتگرون های کلاس 1و 2 به ترتیب 90/39 درصد (تعداد 65 جدایه) و 10/14 درصد (تعداد 23 جدایه) بود. همچنین ارتباط معنی‌داری بین سویه MDR و حضور اینتگرون‌ها مشاهده شد (001/0 P=)، به طوری که میزان حضور اینتگرون‌ها در نمونه‌های MDR  مثبت حدودا 34/6 برابر بیشتر از MDR منفی بود (17). در مطالعه ما نیز بیشتر جدایه های MDR حاوی ژن های اینتگرون کلاس 1 بودند. اینتگرون ها به عنوان یک عنصر ژنتیکی متحرک، نقش مهمی در حفظ و گسترش مقاومت ضد میکروبی در بین باکتری ها، به ویژه باکتری های گرم منفی دارند. طبق نتایج این مطالعه و سایر مطالعات انجام شده، پذیرفته شده است که حضور اینتگرون ها در سویه MDR به طور قابل ملاحظه ای بیشتر از سویه های حساس است (22, 23).

در مطالعه ای که توسط   Raoو همكــاران که در سال 2006 و در کشور امریکا انجام شد، 49درصــد از ايزوله هاي اشریشـيا كلي داراي اينتگـرون كـلاس1 بودنـد و ارتبــاط معنــي داري بــين حضــور اينتگــرون و مقاومــت نســبت بــه آنتــي بيوتيــك هــاي كوتريموكســازول، جنتامايســين، توبرامايسين، سفتازيديم و سفپودوكسيم مشاهده گرديد (24)، در حالی که در مطالعه ما هیچ رابطه معنی داری بین حضور اینتگرون ها و وجود مقاومت به آنتی بیوتیک ها مشاهده نگردید. ذکر این نکته حائز اهمیت است که فراوانی اینتگرون ها در جدایه های مقاوم به آنتی بیوتیک نسبت به جدایه های حساس بیشتر بود. در نتيجه، يكي از دلايـل وجـود مقاومـت دارويـي بالاي اشریشيا كلي در بررسي حاضر را مي توان فراواني بالاي اينتگرون كلاس 1در جدایه های مقاوم به آنتی بیوتیک عنوان كرد. ايـن يافتـه مـي توانـد نشان دهنده ي قرارگيري ژن هاي مقاومت به ايـن آنتـي بيوتيـك هـا در داخل اينتگرون ها باشد و حضور این عوامل مقدمه شیوع جدایه های اشريشيا كلي مقاوم به چند دارو باشد. در نهایت می توان نتیجه گرفت که ژن های مقاومت خصوصا ژن های ESBLs می توانند بر روی انتگرون ها قرار بگیرند و به آسانی در باکتری های گرم منفی خصوصا اشریشیا کلی منتقل شوند.

همچنین نتایج ما نشان داد که 65 عدد از جدایه هایی که به پنج آنتی بیوتیک نالیدیکسیک اسید ، سفوتاکسیم ، سفتازیدیم و کوتریموکسازول مقاومند و دارای ژن اینتگرون کلاس 1 هستند، که به نظر می رسد که احتمالا در کنار این ژن عوامل دیگری در ایجاد مقاومت نقش داشته باشند.

همانطور که اشاره شد کلاس های مختلفی از اینتگرون ها وجود دارد و میزان شیوع آنها در مناطق مختلف جغرافیایی متفاوت بوده و فراوانی اینتگرون کلاس 1 در منطقه مورد مطالعه، و سایر مطالعات به طور قابل مالحظه ای بیشتر از سایر اینتگرون ها بود. از آن جایی که باکتری اشريشيا كلي  از باکتری های فلور طبیعی مشترک بین طیور، حیوانات و انسان است، احتمال انتقال این کاست ژنی بین باکتری های اشريشيا كلي با میزبان های مختلف نیز وجود دارد (25). بنابراین نتیجه شیوع بالای اینتگرون ها مطمئنا ایجاد و گسترش هرچه سریع تر گونه های مقاوم به درمان است و روز به روز، درمان بیماری های انسانی با مشکلات بیشتری مواجه می شود.

نتیجه گیری

این مطالعه شیوع بالای اینتگرون کلاس 1 در جدایه های اشريشيا كلي مولد آنزیم های ESBLs جدا شده از نمونه های بیماران بستری و سرپایی را نشان می دهد، که به کارگیری سیاست هایی جهت کنترل عفونت های ناشی از این باکتری ها بسیار حائز اهمیت می باشد. به طور خلاصه، در منطقه مورد بررسی  ما، اکثر جدایه های اشريشيا كلي که باعث عفونت ادراری می شوند دارای فنوتیپ MDR می باشند. شیوع بالای اینتگرون کلاس 1 در بین جدایه های اشريشيا كلي مولد بتالاکتاماز وسیع الطیف ممکن است به مقاومت به آنتی بیوتیک های رایج کمک کند. بنابراین تعیین دوره ای و منظم الگوهای مقاومت دارویی بـراي بـه كـارگيري برنامه هـاي پيشـگيري از گسـترش هرچـه بيشـتر ايزولـه هـاي اشريشيا كلي داراي مقاومت چند دارویی، ضروري به نظر مي رسد.

ملاحظات اخلاقی

نویسندگان تمامی نکات اخلاقی شامل شامل عدم سرقت ادبی، انتشار دوگانه، تحریف داده ها و داده سازی را در این مقاله رعایت کرده اند.

تشكر و قدرداني

پژوهش حاضر برگرفته از طرح تحقيقاتي با شماره   18S97 مـي باشـد. بدين وسيله از معاونت تحقيقات و فنآوري دانشـگاه علـوم پزشـكي جندی شاپور اهواز به جهت حمايت مـالي ايـن تحقيـق تشـكر و قـدرداني بـه عمل مي آيد.

تعارض در منافع

وجود ندارد.

 

References

1.        Mohammadi-Mehr M, Feizabadi M. Antimicrobial resistance pattern of Gram-negative bacilli isolated from patients at ICUs of Army hospitals in Iran.  Iran J Microbiol. 2011;3(1):26.

2.        FarajzadehSheikh A, Veisi H, Shahin M, Getso M, Farahani A. Frequency of quinolone resistance genes among extended-spectrum β-lactamase (ESBL)-producing Escherichia coli strains isolated from urinary tract infections. Trop Med Health. 2019;47:1-7.

3.        Mohajeri P, Darfarin G, Farahani A. Genotyping of ESBL producing uropathogenic Escherichia coli in west of Iran. Int J Microbiol. 2014;2014.

4.        Mohebi S, Hossieni Nave H, Norouzi A, Kandehkar Gharaman M, Taati Moghadam M. Detection of extended spectrum beta lactamases on class I integron in Escherichia coli isolated from clinical samples. J Mazandaran Univ Med Sci. 2016;26(138):66-76.

5.        Machado E, Cantón R, Baquero F, Galán J-C, Rollán A, Peixe L, et al. Integron content of extended-spectrum-β-lactamase-producing Escherichia coli strains over 12 years in a single hospital in Madrid, Spain. Antimicrob Agents Chemother. 2005;49(5):1823-9.

6.        Ranjbar R, Farahani A. Shigella: antibiotic-resistance mechanisms and new horizons for treatment. Infect Drug Resist. 12: 3137–3167. 2019.

7.        Mohajeri P, Rostami Z, Farahani A, Norozi B. Distribution of ESBL producing Uropathogenic Escherichia coli and carriage of selected [beta]-lactamase genes in Hospital and community isolates in west of Iran. Ann Trop Med Public Health. 2014;7(5):219.

8.        Nikokar I, Tishayar A, Flakiyan Z, Alijani K, Rehana-Banisaeed S, Hossinpour M, et al. Antibiotic resistance and frequency of class 1 integrons among Pseudomonas aeruginosa, isolated from burn patients in Guilan, Iran. Int J Microbiol. 2013;5(1):36.

9.        Moghaddam MJM, Mirbagheri AA, Salehi Z, Habibzade SM. Prevalence of class 1 integrons and extended spectrum beta lactamases among multi-drug resistant Escherichia coli isolates from north of Iran. Int Biomed J. 2015;19(4):233.

10.        Yan H, Li L, Zong M, Alam MJ, Shinoda S, Shi L. Occurrence and characteristics of Class 1 and 2 integrons in clinical bacterial isolates from patients in south China. J health sci. 56(4):442-50.

11.        Wayne P. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing: Twenty seven Informational Supplement M100-S27CLSI. 2021.

12.        Mobasseri P, Harsini MJ, Mehrabian S, Amini K. Detection of Different Types of Class 1, 2 and 3 Integrons among Pseudomonas aeruginosa Isolates from Raw Milks. J Med Bacteriol. 2021:11-8.

13.        Hajiahmadi F, Safari N, Alijani P, Rabiei M, Masomian N, Arabestani MR. Assessment of the Prevalence of Class I and II Integrons of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae Isolates From Hospitals of Hamadan. Avicenna J Clin Med. 2016;23(3):193-201.

14.        Zeighami H, Haghi F, Hajiahmadi F. Integrons and Their role in Antibiotic Resistance. Laboratory & Diagnosis. 2014;5(22):61-71.

15.        Vaziri S, Abiri R, Mansouri F, Alvandi A, Azizi M, Hasanvand B, et al. The Molecular Investigation of Class 1 and 2 Integrons among the Escherichia coli Isolated from Urine Samples of Children in Imam Reza Hospital, Kermanshah City, Iran, in 2016. J Isfahan Med Sch. 2017;35(446):1171-7.

16.        Kargar M, Mohammadalipour Z, Doosti A, Lorzadeh S, Japoni-Nejad A. High prevalence of class 1 to 3 integrons among multidrug-resistant diarrheagenic Escherichia coli in southwest of Iran. Osong Public Health Res Perspect. 2014;5(4):193-8.

17.        Barzegar S, Arzanlou M, Teimourpour A, Esmaelizad M, Yousefipour M, MohammadShahi J, et al. Prevalence of the Integrons and ESBL Genes in Multidrug-Resistant Strains of Escherichia coli Isolated from Urinary Tract Infections, Ardabil, Iran. Iran J Med Microbiol. 2022;16(1):56-65.

18.        Rezaee MA, Sheikhalizadeh V, Hasani A. Detection of integrons among multi-drug resistant (MDR) Escherichia coli strains isolated from clinical specimens in northern west of Iran. Braz J Microbiol. 2011;42:1308-13.

19.        Li W, Ma J, Sun X, Liu M, Wang H. Antimicrobial Resistance and Molecular Characterization of Gene Cassettes from Class 1 Integrons in Escherichia coli Strains. Microb Drug Resist. 2022;28(4):413-8.

20.        Yekani M, Memar MY, Baghi HB, Sefidan FY, Alizadeh N, Ghotaslou R. Association of integrons with multidrug-resistant isolates among phylogenic groups of uropathogenic Escherichia coli. Microbiol Res. 2018;9(1):7484.

21.        Fallah F, Karimi A, Goudarzi M, Shiva F, Navidinia M, Hadipour Jahromi M, et al. Determination of integron frequency by a polymerase chain reaction–restriction fragment length polymorphism method in multidrug-resistant Escherichia coli, which causes Urinary tract infections. Microb Drug Resist. 2012;18(6):546-9.

22.        Behera M, Roshan M, Rajput S, Gautam D, Vats A, Ghorai SM, et al. Novel aadA5 and dfrA17 variants of class 1 integron in multidrug-resistant Escherichia coli causing bovine mastitis. Appl Microbiol Biotechnol. 2023;107(1):433-46.

23.        Al-Hasani HM, Al-Rubaye DS, Abdelhameed A. The Emergence of Multidrug-Resistant (MDR), Extensively Drug-Resistant (XDR), and Pandrug-Resistant (PDR) In Iraqi Clinical Isolates of Escherichia coli. J Popul Ther Clin Pharmacol. 2023;30(5):469-82.

24.        Rao AN, Barlow M, Clark LA, Boring JR, Tenover FC, McGowan JE. Class 1 integrons in resistant Escherichia coli and Klebsiella spp., US hospitals. 2006.

25.        Jouini A, Klibi A, Kmiha S, Hamrouni S, Ghram A, Maaroufi A. Lineages, Virulence Gene Associated and Integrons among Extended Spectrum β-Lactamase (ESBL) and CMY-2 Producing Enterobacteriaceae from Bovine Mastitis, in Tunisia. Pathogens. 2022;11(8):948.

 

1

 

---