Preparation of new biocompatible polymeic nanofibers containing Daphne macronata plant extract and evaluation of its antimicrobial activity
Subject Areas : Environmental pollutions (water, soil and air)Laleh Safavinia 1 , Mohammad Reza Akhgar 2 , Batool Tahamipour 3 , Sayed Ali Ahmadi 4
1 - Department of Chemistry, Faculty of Science, Kerman Branch, Islamic Azad University, Kerman, Iran.
2 - Young Researchers and Elite Club, Sirjan Branch, Islamic Azad University, Sirjan, Iran. *(Corresponding Authors)
3 - Young Researchers and Elite Club, Sirjan Branch, Islamic Azad University, Sirjan, Iran
4 - Department of Chemistry, Faculty of Science, Kerman Branch, Islamic Azad University, Kerman, Iran.
Keywords: Daphne mucronata, Extract, Polyvinyl alcohol, Nanofibers, Antimicrobial.,
Abstract :
Background & Objective: Daphne macronata is one of the species of Daphne genus in Iran that has unique biological properties and has been used as a medicinal plant for a long time. In this study, biocompatible polymer nanofibers from polyvinyl alcohol and Daphne macronata plant extract were prepared as an antimicrobial coating with high efficiency by electrospinning method and its antimicrobial properties on gram-positive, gram-negative and the fungus was examined.
Material and Methodology: In this study, a polymer solution with weight / weight of 12% polyvinyl alcohol polymer was prepared and 2 mL of plant extract was added to 10 mL of polymer solution. In order to prepare nanofibers, the optimal conditions of the electrospinning device including voltage of 17 kV, solution injection rate of 3 mL / h, nozzle head to collector distance of 7 cm and collector speed of 100 rpm were set.
Findings: After preparing the polymer layer, the morphology and diameter of the nanofibers were determined by scanning electron microscopy and the average diameter of the nanofibers prepared under optimal conditions was 80 nm. Examination of the antimicrobial activity of this coating showed that this structure shows a significant antimicrobial effect on bacteria, so that the highest antimicrobial effect was observed on the gram-positive bacterium Streptococcus pyogenes with a growth inhibition zone diameter of 14 mm.
Discussion and conclusion: The nanocoatings obtained in this study can be used as an antimicrobial coating in the biological and medical fields for packaging or wound dressing due to their biocompatible, non-toxic, inexpensive and high efficiency structure.
1. Wang W, Xu J, Fang H, Li Z, Li M. Advances and challenges in medicinal plant breeding. Plant Science. 2020; 298:110573.
2. Bahmani M, Shirzad H, Majlesi M, Shahinfard N, Rafieian-Kopaei M. A review study on analgesic applications of Iranian medicinal plants. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine. 2014; 7:S43-S53.
3. Rajput M, Kumar N. Medicinal plants: A potential source of novel bioactive compounds showing antimicrobial efficacy against pathogens infecting hair and scalp. Gene Reports. 2020;21:100879.
4. Hou X, Hou X, Li L. Chemical constituents from the flower buds of Daphne genkwa (Thymelaeaceae). Biochemical Systematics and Ecology. 2020;91:104055.
5. Khodadadian Z, Hassanpour-Ezatti M, Mousavi SZ, Asgarpanah J. Analgesic and anti-inflammatory potential of aerial parts of the Daphne mucronata Royle extract in mice: Opioid-independent action. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine. 2016;6(3):198-201.
6. Abolmaali SM-R, Tarkesh M, Bashari H. MaxEnt modeling for predicting suitable habitats and identifying the effects of climate change on a threatened species, Daphne mucronata, in central Iran. Ecological Informatics. 2018;43:116-23.
7. Zheng Y, Xie Q, Wang H, Hu Y, Ren B, Li X. Recent advances in plant polysaccharide-mediated nano drug delivery systems. International Journal of Biological Macromolecules. 2020;165:2668-83.
8. Zhang W, He Z, Han Y, Jiang Q, Zhan C, Zhang K, et al. Structural design and environmental applications of electrospun nanofibers. Composites Part A: Applied Science and Manufacturing. 2020;137:106009.
9. Ibrahim HM, Klingner A. A review on electrospun polymeric nanofibers: Production parameters and potential applications. Polymer Testing. 2020;90:106647.
10. Topuz F, Uyar T. Antioxidant, antibacterial and antifungal electrospun nanofibers for food packaging applications. Food Research International. 2020;130:108927.
11. Homaeigohar S, Boccaccini AR. Antibacterial biohybrid nanofibers for wound dressings. Acta Biomaterialia. 2020;107:25-49.
12. Kim JH, Lee H, Jatoi AW, Im SS, Lee JS, Kim I-S. Juniperus chinensis extracts loaded PVA nanofiber: Enhanced antibacterial activity. Materials Letters. 2016;181:367-70.
13. Aruan NM, Sriyanti I, Edikresnha D, Suciati T, Munir MM, Khairurrijal. Polyvinyl Alcohol/Soursop Leaves Extract Composite Nanofibers Synthesized Using Electrospinning Technique and their Potential as Antibacterial Wound Dressing. Procedia Engineering. 2017;170:31-5.
14. Abubakar A, Haque M. Preparation of medicinal plants: Basic extraction and fractionation procedures for experimental purposes. Journal of Pharmacy And Bioallied Sciences. 2020;12(1):1-10.
15. Hedayati M, Yazdanparast R, Fasihi H, Azizi F. Anti-tumor Activity of Daphne mucronata Extract and its Effects on TNF-a Receptors and TNF-a Release in Cultured Human Monocytes. Pharmaceutical Biology. 2003;41(3):194-8.
16. Supaphol P, Chuangchote S. On the electrospinning of poly(vinyl alcohol) nanofiber mats: A revisit. Journal of Applied Polymer Science. 2008;108(2):969-78.
17. Tian H, Yuan L, Wang J, Wu H, Wang H, Xiang A, et al. Electrospinning of polyvinyl alcohol into crosslinked nanofibers: An approach to fabricate functional adsorbent for heavy metals. Journal of Hazardous Materials. 2019;378:120751.
18. Liu B, Hu T, Yan W. Authentication of the Bilberry Extracts by an HPLC Fingerprint Method Combining Reference Standard Extracts. Molecules. 2020;25(11):2514.
19. Balouiri M, Sadiki M, Ibnsouda SK. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 2016;6(2):71-9.
20. Guimarães AC, Meireles LM, Lemos MF, Guimarães MC, Endringer DC, Fronza M, et al. Antibacterial Activity of Terpenes and Terpenoids Present in Essential Oils. Molecules. 2019;24(13).
21. Inoue M, Suzuki R, Koide T, Sakaguchi N, Ogihara Y, Yabu Y. Antioxidant, Gallic Acid, Induces Apoptosis in HL-60RG Cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 1994;204(2):898-904.
22. Dulloo AG, Seydoux J, Girardier L, Chantre P, Vandermander J. Green tea and thermogenesis: interactions between catechin-polyphenols, caffeine and sympathetic activity. International Journal of Obesity. 2000;24(2):252-8.
23. Garg A, Garg S, Zaneveld LJD, Singla AK. Chemistry and pharmacology of the citrus bioflavonoid hesperidin. Phytotherapy Research. 2001;15(8):655-69.
24. Panahi Kokhdan E, Mianabadi M, Sadeghi H, Khalaf M. The Effects of Two Species of Daphne, Betulin and Betulinic Acid on Alkaline Phosphatase Activity in Two Human Cancer Cell lines, K562 and MCF-7. yums-armaghan. 2014;18(11):900-9.
25. Zaidi A, Bukhari S, Khan F, Noor T, Iqbal N. Ethnobotanical, Phytochemical and Pharmacological Aspects of Daphne mucronata (Thymeleaceae). Tropical Journal of Pharmaceutical Research. 2015;14:1517-.
26. Ashraf I, Zubair M, Rizwan K, Rasool N, Jamil M, Khan SA, et al. Chemical composition, antioxidant and antimicrobial potential of essential oils from different parts of Daphne mucronata Royle. Chemistry Central Journal. 2018;12(1):135.
27. Li X, Kanjwal MA, Lin L, Chronakis IS. Electrospun polyvinyl-alcohol nanofibers as oral fast-dissolving delivery system of caffeine and riboflavin. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2013;103:182-8.
28. Javidnia K, Miri R, Bahri Najafi R, Khademzadeh Jahromi N. A PRELIMINARY STUDY ON THE BIOLOGICAL ACTIVITY OF DAPHNE MUCRONATA ROYLE. DARU JOURNAL OF PHARMACEUTICAL SCIENCE. 2003;11(1):28-31.
29. Talei GR, Meshkat Alsadat M, Delfan B. ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF FRUIT, LEAVES EXTRACTS OF ARTEMISIA PERSICA BOISS, RHUS CORIARIA, EPHEDRA INTERMEDIA AND DAPHNE MUCRONATA ROYLE OF LORESTAN. YAFTEH. 2004;5(18):19-23.
تهيه نانوالياف پليمري زيستسازگار جديد حاوي عصاره گياه دافنه ماکروناتا و بررسي فعاليت ضدميکروبي آن
Preparation of new biocompatible polymeic nanofibers containing Daphne macronata plant extract and evaluation of its antimicrobial activity
Abstract:
Background and aim: Daphne macronata is one of the species of Daphne genus in Iran that has unique biological properties and has been used as a medicinal plant for a long time. In this study, biocompatible polymer nanofibers from polyvinyl alcohol and Daphne macronata plant extract were prepared as an antimicrobial coating with high efficiency by electrospinning method and its antimicrobial properties on gram-positive, gram-negative and the fungus was examined.
Methods: In this study, a polymer solution with weight / weight of 12% polyvinyl alcohol polymer was prepared and 2 mL of plant extract was added to 10 mL of polymer solution. In order to prepare nanofibers, the optimal conditions of the electrospinning device including voltage of 17 kV, solution injection rate of 3 mL / h, nozzle head to collector distance of 7 cm and collector speed of 100 rpm were set.
Results: After preparing the polymer layer, the morphology and diameter of the nanofibers were determined by scanning electron microscopy and the average diameter of the nanofibers prepared under optimal conditions was 80 nm. Examination of the antimicrobial activity of this coating showed that this structure shows a significant antimicrobial effect on bacteria, so that the highest antimicrobial effect was observed on the gram-positive bacterium Streptococcus pyogenes with a growth inhibition zone diameter of 14 mm.
Conclusion: The nanocoatings obtained in this study can be used as an antimicrobial coating in the biological and medical fields for packaging or wound dressing due to their biocompatible, non-toxic, inexpensive and high efficiency structure.
چکيده:
زمینه و هدف :گياه دافنه ماکروناتا يکي از گونههاي جنس دافنه در ايران است که داراي خواص زيستي منحصر به فرد بوده و از ديرباز بهعنوان يک گياه دارويي استفاده شده است. در اين مطالعه، نانوالياف پليمري زيستسازگار از پليوينيل الکل و عصاره گياه دافنه ماکروناتا به عنوان پوشش ضدميکروبي با کارآيي بالا به روش الکتروريسي تهيه و خواص ضدميکروبي آن بر روي باکتري های گرممثبت، گرممنفي و قارچ بررسي شد.
روش بررسی : در این تحقیق محلول پليمري با درصد وزني/وزني 12 درصد از پليمر پليوينيل الکل تهيه شد و 2 ميليليتر، از عصاره گياهي به 10 ميليليتر از محلول پليمري افزوده شد. به منظور تهيه نانوالياف، شرايط بهينه دستگاه الکتروريسي شامل ولتاژ 17 کيلوولت، نرخ تزريق محلول 3 ميليليتر بر ساعت، فاصله سر نازل تا جمعکننده 7 سانتيمتر و سرعت جمعکننده 100 دور بر دقيقه تنظيم شد.
یافته ها : بعد از تهيه لايه پليمري، مورفولوژي و قطر نانوالياف به کمک تصوير ميکروسکوپ الکتروني روبشي معين شد و قطر متوسط نانوالياف تهيه شده در شرايط بهينه، برابر 80 نانومتر بهدست آمد. بررسي فعاليت ضدميکروبي اين پوشش نشان داد که اين ساختار اثر ضدميکروبي قابلتوجهی بر روي باکتريها نشان ميدهد، به طوري که بيشترين اثر ضدميکروبي بر روي باکتري گرممثبت استرپتوکوکوس پیوژنز با قطر هاله عدم رشد 14 ميليمتر مشاهده شد.
نتیجه گیری : نانوپوشش حاصل در این پژوهش به دليل ساختار زيستسازگار، غيرسمي، ارزان قيمت و کارآيي بالا ميتواند به عنوان پوشش ضدميکروبي در حوزه زيستي و پزشکي جهت بستهبندي يا پوشش زخم مورد استفاده قرار گيرد.
واژههاي کليدی: دافنه ماکروناتا ، عصاره، پليوينيل الکل، نانوالياف، ضدميکروبي
مقدمه
گياهان دارويي ميراثهاي بومي هر کشوري به شمار ميآيند كه از اهميت فراگير و جهاني در صنايع مختلف به ویژه پزشکی برخوردار هستند(1). تنوع و تعداد گونههاي گياهي با خواص دارويي، در ايران بسيار زياد است به طوري كه نتايج بررسيها نشان داده است که حدود 8 هزار گونه گونههاي گياهي داراي خواص دارويي در ايران وجود دارد(2). در سالهاي اخير، گسترش مقاومت سويههاي ميکروبي به آنتيبيوتيکها از يک سو و افزايش هزينه توليد ترکيبات دارويي جديد از سوي ديگر باعث شده است که محققان از ترکيبات ارزان قيمت طبيعي مانند عصاره گياهان دارويي به عنوان ترکیبات ضد میکروبی استفاده کنند. فراواني، هزينه پايين توليد و زيستسازگاري اين ترکيبات، آنها را به گزينهاي مناسب براي مهار انواع سويههاي باکتريايي تبديل نموده است(3).
گیاه دافنه1 یکی از گياهان دارويي شناخته شده در ايران است که شامل 5 گونه مختلف است (4) یک گونه از این گیاه با عنوان دافنه ماکروناتا2 از زمانهاي گذشته براي درمان بيماريهاي روماتيسمي، درد مفاصل، بيماريهاي پوستي و برخي از انواع سرطان مورد استفاده ميشده است (5). در ايران اين گياه در دامنههاي جنوبي البرز و استانهاي مرکزي از جمله اصفهان، فارس و کرمان انتشار دارد و در مناطق کوهستاني به خوبي رشد ميکند(6).
با توجه به اينکه گزارشهاي کمي در مورد خواص دارويي اين گياه منتشر شده است و نيز ميزان و کيفيت مواد موثره دارويي در اين گياه در مناطق مختلف ايران متاثر از عوامل اکولوژيکي و اقليمي هر منطقه ميباشد، لذا تحقيق در مورد بررسي ترکيب شيميايي اين گياه در مناطق مختلف و همچنين خواصدارويي اين گياه بيش از پيش ضروري به نظر ميرسد.
امروزه فناوري نانو به دليل خواص منحصر به فرد در محصولات، توجه جهاني را به خود جلب کرده است. در حوزه پزشکي و دارويي نيز فناوري نانو، روشهاي زيادي براي فرآوري داروهاي گياهي به ارمغان آورده که ميتواند باعث بهبود و ارتقاي کيفيت سيستمهاي دارورساني شود(7).
يکي از کاربرديترين ساختارهاي نانويي، نانوالياف هستند که به دليل خواص جالب توجه، کاربردهاي صنعتي زيادي پيدا کردهاند. كاربردهاي نانوالياف در زمينههاي زيستي و پزشکي شامل بستهبندي مواد غذايي، تثبيـت آنــزيم، مهندســي بافــت و پوشــش زخــم ميباشد(8, 9). با اين وجود، نانوساختارهاي پليمري به دليل تخلخل زياد، محيط مناسبي براي رشد ميکروبها هستند و ميتوانند سبب انتقال انواع بيماريها شوند. همچنين، تـجزيه بيولوژيـــکي نانوالياف توسط ميکروبها ميتواند سبب تغيير رنگ و کاهش خواص مکانيکي و کششي الياف شده و موجبات پوســيدگي آنها را فراهم آورد. امروزه تهيه پوشش نانوالياف ضدميکروبي به دليل کاربرد پزشکي و زيستي فراوان مورد توجه محققين قرار گرفته است(10). خواص ضدميکروبي در نانوالياف مورد استفاده به عنوان پوشش زخم نيز از اهميت بالايي برخوردار است. استفاده از زخمپوشهاي نانوليفي ضدميکروبي مانع عفونت زخم شده و موجب تسريع در بهبودي زخم و در نتيجـه كاهش طول مدت درمان ميگردد (11).
تا بهحال گزارشهاي زيادي از کاربرد نانوالياف ضدميکروبي با استفاده از ترکيبات پليمري و عصارههاي گياهي مختلف جهت کاربردهاي متفاوت ارائه شده است(12, 13). با وجود خواص دارويي جالب توجه گونه گياهی دافنه ماکروناتا ، تا کنون استفاده از عصاره اين گياه در نانوالياف گزارش نشده است. در اين پژوهش، ساخت نمونه جديد از نانوالياف پليوينيل الکل3 و عصاره اين گونه گياهي به عنوان پوشش ضدميکروبي موثر و ارزان مورد توجه قرار گرفته است. بدين منظور، ابتدا ترکيبات عصاره اين گياه شناسايي و سپس نانوالياف حاوي عصاره تهيه و در نهايت فعاليت ضدميکروبي آن بررسي شده است.
روش بررسی
مواد و روشها
مواد شيميايي مورد نياز شامل پليمر پليوينيل الکل با وزن مولکولي 100000، حلال متانول با درجه خلوص 95 درصد، حلال ديمتيل –سولفوکسيد 4با درجه خلوص 98 درصد، محيط کشت مولر-هينتون آگار 5به شماره Cat.No.1.05437، اسيد سولفوريک 95 درصد و پودر کلريد باريم بدون آب جهت ساخت استاندارد مک فارلند 6 از شرکت مرک آلمان تهيه شد و بدون خالصسازي بيشتر مورد استفاده قرار گرفت.
ميکروارگانيسمهاي استفاده شده جهت انجام تست ضدميکروبي، شامل باکتريهاي گرم مثبت Bacillus cereus (PTCC 1665)، Staphylococcus epidermidis (PTCC 1435) و Streptococcus pyogenes PTCC (1447) و باکتريهاي گرم منفي Salmonella enterica (PTCC 1709) و Acinetobacter baumannii (PTCC 1855) و قارچ Fusarium oxysporum ( PTCC 5115) بودند که از بانک ميکروبي مرکز پژوهشهاي علمي و صنعتي ايران تهيه شدند.
تهيه عصاره گياهي
گونه دافنه ماکروناتا پس از جمعآوري از مناطق کوهستاني اطراف شهرستان جيرفت، توسط متخصصين گياهشناس دانشگاه شهيد باهنر کرمان شناسايي و مورد تأييد قرار گرفت. سپس برگهاي تازه گياه با آب مقطر به خوبي شستشو داده شدند و به مدت يک هفته در دماي اتاق بـه دور از نور مستقيم خورشيد خشك شدند. برگهای خشک شده، در شرايط استريل توسط آسياب برقي به صورت پودر درآمدند. عصارهگيري از برگهای گياه، به وسيله حلال متانول 80% با روش خيساندن انجام شد. سپس محلول در دماي 50 درجه سانتيگراد براي مدت يک ساعت بر روي شيکر به هم زده شد. پس از خنک شدن و انجام عمل فيلتراسيون توسط کاغذ صافي واتمن 42، جهت از بين بردن تمامي ذرات معلق به مدت 30 دقيقه به وسيله دستگاه سانتريفيوژ با سرعت 10000 دور در دقيقه سانتريفيوژ شد. در نهايت، عصاره به دست آمده در ويالهاي استريل و براي استفادههاي بعدي در يخچال با دماي تقريبي 4- درجه سانتيگراد نگهداري شد.(14), (15)
توليد لايه نانوالياف به روش الكتروريسي
برای تهیه نانو الیاف ابتدا محلول پليمري با درصد وزني/وزني 12 درصد از پليمر پليوينيل الکل بر اساس مطالعات قبلي تهيه شد(16). در مرحله بعد و پس از تعيين شرايط مطلوب الكتروريسي، مقدار 2 ميليليتر، از عصاره گياهي به 10 ميليليتر از محلول پليمري مطلوب افزوده و مخلوط حاصل درون ظروف محافظت شده از نور، به مدت 2 ساعت بر روي همزن مغناطيسي و در دماي محيط قرار گرفت تا محلول كاملاً يكنواختي حاصل گردد.
جهت تهيه نانوالياف از دستگاه الكتروريسي شركت نانو آزما، ساخت كشور ايران استفاده شد. اين دستگاه مجهز به دو سامانه مستقل تامينكننده ولتاژ بالا، هر يك به ميزان 30 کيلوولت و 2 پمپ الكتروريسي با سرنگ 5 سيسي، سوزن مدل اسپاينال ٢٢ و يک جمعكننده ميباشد. در اين تحقيق، محلول پليمري داخل يک سرنگ ريخته شد و فاصله سوزن تا جمعکننده 7 سانتيمتر، ولتاژ دستگاه 17 کيلوولت، نرخ تزريق 3 ميليليتر بر ساعت و سرعت چرخش جمعکننده 100 دور بر دقيقه تنظيم شد. بعد از يک ساعت کار دستگاه، لايه نازکي از نانوالياف پليمري حاوي عصاره گياهي بر روي جمعکننده تشکيل شد. مورفولوژي و قطر نـانواليـاف حاصـل از فرايند الكتروريسي با اسـتفاده از ميكروسـكوپ الكترونـي روبشـي بررسي شد.(17)
شناسايي ترکيبات موجود در عصاره
شناسايي ترکيبات عصاره به روش GC/MS انجام شد. به اين منظور از دستگاه GC/MS مدلAgilent 3223 با ستون موئين HP5 به طول 30 متر استفاده شد. برنامه حرارتي 50 تا 280 درجه سانتيگراد با افزايش دماي 4 درجه سانتيگراد در دقيقه، گاز حامل، هليوم با جريان 5/1 ميليليتر در دقيقه، دماي محفظه تزريق و دماي دتكتور 270 درجه سانتيگراد و نسبت شكافت 10:1 بود. طيف جرمي ترکيبات در 70 الکترونولت با گستره جرمي 50 تا amu 470 ثبت گرديد. همچنين، اطلاعات كمي به وسيله انتگراسيون الكتروني از سطح زير پيكها بهدست آمد. شناسايي ترکيبهاي تشکيلدهنده عصاره با مقايسه طيفهاي جرمي و شاخصهاي بازداري بدست آمده با طيفهاي جرمي و شاخصهاي بازداري ترکيبهاي استاندارد انجام شد.(18)
بررسي خواص ضدميکروبي
فعاليتهاي ضدميکروبي ترکيبات شامل تعيين حداقل غلظت بازدارندگي، تعيين حداقل غلظت کشندگي و تعيين قطر هاله عدم رشد بررسي شد. تعيين حداقل غلظت بازدارندگي با روشهاي انتشار ديسک طبق دستورالعمل CLSI، M07-A9 و M27-A2 صورت گرفت. حداقل غلظت کشندگي نيز طبق دستورالعمل CLS، M26-A صورت گرفت.(19, 20)
تعيين حداقل غلظت بازدارندگي7
ابتدا سويههاي باکتريايي گرممثبت و گرممنفي با غلظت نيممکفارلند در محيط کشت مايع مولر-هينتون تهيه شد. سپس غلظتهاي مختلفي از ترکيبات سنتز شده در حلال ديمتيل سولفوکسيد8 تهيه و از هر غلظت، مقدار 20 ميکروليتر به ترتيب در چاهکهاي يک رديف از پليت 96 خانه انتقال داده شد. مقدار 170 ميکروليتر محيط کشت مايع مولر-هينتون براث و 10 ميکروليتراز سويههاي باکتريايي و قارج به هر چاهک اضافه و به مدت 24 ساعت داخل انکوباتور شيکردار با دماي 37 درجه سانتيگراد قرار داده شد. در نهايت، کمترين غلظتي را که داخل چاهک کدورت مشاهده نشد به عنوان حداقل غلظت بازدارندگي (MIC) گزارش گرديد. در چاهک آخر هر رديف، به عنوان کنترل منفي، فقط حلال ديمتيل سولفوکسيد و سويه باکتري ريخته شد. آزمون مذکور براي داروی جنتامايسين نيز به عنوان شاهد صورت گرفت.
تعيين حداقل غلظت کشندگي9
براي تعيين حداقل غلظت کشندگي، محلول موجود در چاهک حداقل غلظت بازدارندگي و سه الي چهار غلظت بالاتر از آن را با سوآپ به صورت جداگانه بر روي پليت حاوي محيط کشت جامد مولر-هينتون آگار کشت و به مدت 24 ساعت در دماي 37 درجه سانتيگراد قرار داده شد. پس از زمان مذکور، پليتها بررسي و غلظتي که باکتري و قارچ رشد نکرده بود به عنوان حداقل غلظت کشندگي (MBC) گزارش شد.
تعيين قطر هاله عدم رشد10
براي تعيين قطر هاله عدم رشد، ابتدا با سوآپ سويههاي باکتريايي و قارچ بر روي پليتهاي حاوي محيط کشت جامد مولر-هينتون آگار کشت داده و روي آنها ديسک بلانک قرار داده شد. سپس مقدار 20 ميکروليتر از غلظت حداقل بازدارندگي مشتقاتي که داراي اثرات ضدباکتريايي برعليه سويه باکتري مورد نظر بودند بر روي ديسک بلانک تزريق و به مدت 24 ساعت در دماي 37 درجه سانتيگراد قرار داده شد. در نهايت، پليتها را برداشته و قطر هاله ايجاد شده، توسط کوليس اندازهگيري شد.
مشخصهيابي نانوالياف
به منظور مشاهده ساختار نانوالياف تهيه شده و ساختار شبكه پليمري، از ميكروسكوپ الكتروني روبشي مدل Mira 3-TESCAN استفاده شد. همچنين قطر نانوالياف با استفاده از روش پردازش تصوير و نرم افزار Image-J 1.46r ، توليد كشور آمريكا محاسبه شد. به منظور تاييد وجود عصاره گياهی در نمونه نانوالياف، از طيفسنج مادون قرمز11 (FTIR) با دقت cm-14 و در محدوده cm-1 4000-400 استفاده شد.
یافته ها و بحث
شناسايي ترکيبات شيميايي عصاره گياه
استفاده صحيح از گياهان دارويي مستلزم اطلاعات دقيق علمي و شناخت تركيبات شيميايي موجود در آنهاست. زيرا وجود تركيبات شيميايي خاص در گياه است كه باعث خواص درماني آن ميگردد. در اين تحقيق، ترکيبات شيميايي موجود در عصاره متانولی برگ گونه گياهي دافنه ماکروناتا به روش GC/MS شناسايي شد. شکل 1 منحني کروماتوگرافي گازي عصاره گياه را نشان ميدهد. در جدول 1 ترکيبات اصلی شناساييشده در عصاره گياه، همراه با زمان بازداري اين ترکيبات نشان داده شده است.
شکل 1: نمودار کروماتوگرافي گازي عصاره متانولي دافنه ماکروناتا
Figure 1: Gas chromatographic diagram of Daphne Macronata methanolic extrac
جدول 1 :ترکيبات اصلی شناساييشده در عصاره متانولي دافنه ماکروناتا
Table 1: Main compounds identified in Daphne macronata methanolic extract
نام ترکيب | ميلیگرم بر ليتر | زمان بازداري (دقيقه) |
گاليک اسيد | 135 | 3/3 |
کاتچين | 1531 | 3/8 |
هسپريدين | 1066 | 5/18 |
نتايج نشان داد که در عصاره اين گياه 17 ترکيب مختلف وجود دارد که 3 ترکيب گاليک اسيد، کاتچين و هسپردين درصد بيشتري از عصاره اين گياه را به خود اختصاص ميدهند. گاليک اسيد يا تريهيدروکسي بنزوئيک اسيد ترکيبي از خانواده پليفنلها با خاصيت آنتياکسيداني، ضدقارچي و ضدباکتريايي قوي است که در عصاره برخي از گياهان دارويي يافت ميشود(21). همچنين، كاتچين يك مكمل گياهي و پليفنول قوي و محلول در آب است. اين تركيب يكي از مواد مهم در برگ سبز چاي محسوب ميشود. اين تركيب در گروه فلاونوئيدها قرار داشته و اثر ضدميکروبي قوي دارد(22). هسپريدين نيز يک بيوفلاونوئيد با اثرات آنتياکسيداني و ضدالتهابي است که در مرکبات يافت ميشود(23). در ديگر تحقيقات انجام شده بر روي گونه گياهي دافنه ماکروناتا ، ترکيبات موجود در عصاره آن شناسايي شدهاند که با نتايج به دست آمده در اين تحقيق شباهتها و تفاوتهايي دارند. در تحقيقي که توسط پناهي و همکاران انجام شده است، ترکيب بتولين از عصاره اين گياه به دست آمد.(24) بتولين يک تريترپن طبيعي موجود درگياهان جنس دافنه است که خاصيت ضدتوموري آن در برخي از انواع سرطانها تأييد شده است. بتولين ميتواند به بتولينيک اسيد تبديل گردد که از نظر زيستي ترکيبي فعالتر از بتولين است. بتولينيک اسيد يک تريترپنوئيد پنتاسيکليک طبيعي است که داراي خواص دارويي زياد ميباشد.با توجه به اينکه اين گونه گياهي در پاکستان نيز يافت ميشود تحقيقاتي در ارتباط با شناسايي ترکيبات موجود در عصاره اين گياه در اين کشور انجام شده است. در تحقيقي که توسط زيدي و همکاران صورت گرفت، ترکيبات موجود در عصاره متانولي گياه شناسايي شد و انواع ترکيبات شيميايي شامل کومارين، کربوکسيليک اسيدها، فلاونوئيد و ترپنوئيد از اين گياه به دست آمد که با ترکيبات به دست آمده در اين تحقيق نيز مشابهت دارند (25). همچنين، در تحقيقي که توسط اشرف و همکاران بر روي ترکيبات روغني به دست آمده از ريشه و برگ اين گياه انجام شد، انواع ترکيبات هيدروکربني و الکلي در عصاره گياه شناسايي شد که با ترکيبات شناسايي شده در اين تحقيق تفاوت دارند (26).
به منظور ارزيابي اندازه، قطر و شکل نانوالياف توليد شده، تصاوير ميکروسکوپ الکتروني روبشي از نمونههاي نانوالياف پليوينيل الکل با عصاره گياهي تهيه شد. (شکل 2).
شکل 2 : تصوير ميکروسکوپ الکتروني نانوالياف پليوينيل الکل حاوي عصاره گياه
Figure 2: Electron microscope image of polyvinyl alcohol nanofibers containing plant extract
نانوالياف پليمري جهت کاربرد به عنوان پوشش، نيازمند کنترل مورفولوژي و ساختار نانوالياف به شکل يک لايه مداوم و يکنواخت ميباشد. عوامل گوناگوني بر روي ساختار و مورفولوژي نانوالياف توليدي از فرآيند الکتروريسي تاثيرگذارند که مهمترين آنها غلظت محلول و شرايط الکتروريسي است. غلظت محلول پليوينيل الکل در اين تحقيق با توجه به پژوهشهاي انجام شده قبلي، به ميزان 12 درصد و غلظت عصاره گياهي 20 درصد انتخاب شد. (27).
تصوير ميکروسکوپ الکتروني به دست آمده از نمونه جمعآوري شده بر روي فويل آلومينيومي، الياف مناسبي را نشان داد كه از نظر قطر ذرات و يكنواختي و شبكهايشدن قابلقبول هستند. به طوري كه ميانگين قطر الياف در محدوده 80 نانومتر است. همچنين، تشکيل الياف يکنواخت و بدوندانه نشان ميدهد که وارد کردن عصاره گياهي در بافت پليمري با غلظت20 درصد، تغيير چنداني در بافت نانوالياف ايجاد نميکند. تشکيل الياف يکنواخت و منظم با عصاره گياهي در اين طرح به دليل امکان تنفس بهتر و عبور بهتر هوا، کاربرد اين پوشش را در پانسمان زخم و نيز بستهبنديهاي مواد خوراکي افزايش ميدهد. براي بررسي و شناسايي دقيقتر ساختار نانوالياف سنتز شده پليوينيل الکل و عصاره گياه، طيف مادونقرمز آن تهيه و مورد بررسي قرار گرفت (شکل 3). در طيف مادون قرمز اين ترکيب پيکهاي مربوط به گروههايOH در cm-1 3323، گروه کربونيل در cm-1 1716 و پيک مربوط به پيوندهاي کربني آروماتيک در cm-1 1616 مشاهده شده است که با ساختار شيميايي ترکيب پليوينيلالکل و ترکيبات اصلي شناساييشده در عصاره گياهي مطابقت داشته و وجود عصاره گياهي در بافت نانوالياف را تاييد ميکند.
شکل 3 طيف مادون قرمز نانوالياف پليوينيل الکل حاوي عصاره گياه
Figure 3 Infrared spectrum of polyvinyl alcohol nanofibers containing plant extracts
فعاليت ضدميکروبي نانوالياف
ميکروارگانيسمها از عوامل مهم ايجاد بيماري در انسان ميباشند و خطرات ناشي از وجود آنها موجب شده است که محققين به فکر روشهاي موثرتر براي مقابله با آنها باشند. در اين پژوهش، فعاليت ضدميکروبی نانوالياف حاوي عصاره گياهي مورد بررسي قرار گرفت. به اين منظور، ابتدا فعاليت ضدميکروبي عصاره دافنه ماکروناتا به صورت خالص و سپس نمونه نانوالياف حاوي عصاره گياهي بر روي سه گونه باکتري گرممثبت Bacilus cereus، Streptococcus pyogenes و Staphlococcus epidermidis، دو گونه باکتري گرممنفي Salmonella enteric و Acinetobacter baumannii و همچنين قارچ Fusarium oxysporum بررسي شد. نتايج نشان داد که نانوالياف حاوي عصاره گياهي، فعاليت ضدميکروبي قابلتوجهي بر روي باکتريهاي گرممثبت و گرممنفي مورد آزمايش نشان ميدهند (جدول 2).
به طوری که بيشترين قطر هاله عدم رشد در نانوالياف حاوي عصاره، بر روي باکتريگرممثبت Streptococcus pyogenes با قطر هاله 14 ميليمتر مشاهده شد. کمترين قطر هاله ضدميکروبي در باکتري گرم منفي Acinetobacter baumannii با قطر هاله 10 ميليمتر مشاهده شد.
سويه ميکروبی | شاخص بررسیشده | عصاره
| عصاره و نانوالياف
| جنتاميسين |
Bacillus cereus (PTCC 1665) | قطر هاله عدم رشد (mm) | 11 | 13 | 24 |
حداقل غلظت بازدارندگي (mg/mL) | 32 | 512 | 1 | |
حداقل غلظت کشندگي (mg/mL) | 64 | 1024 | 4 | |
Streptococcus pyogenes (PTCC 1447) | قطر هاله عدم رشد (mm) | 13 | 14 | 14 |
حداقل غلظت بازدارندگي (mg/mL) | 512 | 256 | 4 | |
حداقل غلظت کشندگي (mg/mL) | 1024 | 512 | 4 | |
Staphylococcus epidermidis (PTCC 1435) | قطر هاله عدم رشد (mm) | 12 | - | 25 |
حداقل غلظت بازدارندگي (mg/mL) | 512 | - | 2 | |
حداقل غلظت کشندگي (mg/mL) | 1024 | - | 4 | |
Salmonella enterica (PTCC 1709) | قطر هاله عدم رشد (mm) | 13 | 12 | 26 |
حداقل غلظت بازدارندگي (mg/mL) | 512 | 2048 | 4 | |
حداقل غلظت کشندگي (mg/mL) | 1024 | 4096 | 8 | |
Acinetobacter baumannii (PTCC 1855) | قطر هاله عدم رشد (mm) | 9 | 10 | 19 |
حداقل غلظت بازدارندگي (mg/mL) | 2048 | 1024 | 32 | |
حداقل غلظت کشندگي (mg/mL) | 4096 | 1024 | 64 | |
Fusarium oxysporum (PTCC 5115) | قطر هاله عدم رشد (mm) | 12 | 12 | 23 |
حداقل غلظت بازدارندگي (mg/mL) | 512 | 2048 | 64 | |
حداقل غلظت کشندگي (mg/mL) | 1024 | 4096 | 128 |
جدول 2 فعاليت ضدميکروبي عصاره گياه و نانوالياف حاوي عصاره گياه بر روي باکتريهاي گرممثبت، گرممنفي و قارچ
Table 2 Antimicrobial activity of plant extracts and nanofibers containing plant extracts on gram-positive, gram-negative and fungal bacteria
آنالیز آماری اثر عصاره گياه و نانوالياف حاوي عصاره گياه بر روي سويه ميكروبي انجام شد ( شکل 4 ) . مقایسه میانگینها (میانگین سه تکرار) با استفاده از آزمون دانکن انجام شد (P<0.05). میانگینهایی که حداقل یک حرف مشترک دارند، از نظر آماری اختلاف معنیداری ندارند (P<0.05)
شکل 4: نتایج آنالیز آماری اثر عصاره گیاه و نانوالیاف حاوی عصاره گیاه بر روی سویه های میکروبی
مطالعات مختلف انجام شده توسط ساير محققين نيز اثر ضدباکتريايي گونه دافنه ماکروناتا را به اثبات رساندهاند. در تحقيق انجام شده توسط جاويدنيا و همکاران، فعاليت ضدميکروبي عصاره آبي و الکلي برگ، ساقه و ريشه دافنه ماکروناتا ، جمعآوري شده از استان فارس، بر روي باکتريهاي مختلف بررسي شد. نتايج نشان داد که عصاره متانولي، بيشترين اثر را بر روي باکتري Streptococcus aureus دارد(28). از طرف ديگر، در تحقيق انجام شده توسط طلايي و همکاران، فعاليت ضدميکروبي عصاره آبي و الکلي برگ و ريشه Daphne mucronata، جمعآوري شده از منطقه لرستان بر روي باکتريهاي مختلف بررسي شد. نتايج نشان داد که عصاره متانولي اين گياه بيشترين اثر را بر روي باکتري دهاني Streptococcus mutans دارد (29).اشرف و همکاران در پاکستان، فعاليت ضدميکروبي عصاره برگ گونه دافنه ماکروناتا را مورد بررسي قرار دادند. نتايج اين بررسي نشان داد که عصاره اين گياه اثر ضدميکروبي قابلتوجهي بر روي قارچ Candida albicans نشان ميدهد، به طوري که قطر هاله عدم رشد آن 22 ميليمتر بود.(26)
بررسي نتايج تحقيقات انجام شده، نشان ميدهد که عصاره گياه دافنه ماکروناتا ، به دست آمده از مناطق مختلف، فعاليت ضدميکروبي قابلملاحظهاي بر روي باکتريهاي مختلف نشان ميدهد. اين اثر را ميتوان به حضور ترکيبات فنولي در اين گياه نسبت داد.
نتيجهگيري
نانوالياف پليمري، نانوساختارهاي مهمي هستند که کاربرد زيادي در صنعت و پزشکي دارند. گسترش آلودگيهاي ميکروبي در محيطهاي بيمارستاني و صنعتي، مشکلاتي را در استفاده از نانوالياف ايجاد کرده است. حضور ميکروارگانيزمها بر روي نانوالياف، ضمن انتقال آلودگي ميتواند سبب ايجاد تأثيرات نامطلوبي نظير تجزيه مواد سازنده الياف، کاهش استحکام و در نهايت پوسيدگي منسوج شود. در اين پژوهش، پوشش نانوالياف پليمري جديدي از پليوينيل الکل و عصاره گياه دافنه ماکروناتا به روش الکتروريسي تهيه شد و خواص ضدميکروبي آن بر روي چند نمونه باکتري بيماريزا مورد بررسي قرار گرفت. بررسي ساختار به دست آمده نشان داد که نانوالياف پليمري حاوي عصاره گياهي با ميانگين قطر 80 نانومتر تهيه شدند. همچنين، فعاليت ضدميکروبي نانوپوشش در مقابل باکتريهاي گرممثبت و گرممنفي نشان داد که اين ساختار ميتواند اثر بازدارنگي قابلتوجهي بر روي انواع باکتريها به ويژه Streptococcus pyogenes داشته باشد. نانوپوشش حاصل به دليل ساختار زيستسازگار، غيرسمي، ارزان قيمت و کارآيي بالا ميتواند جايگزين مناسبي براي پوششهاي پليمري مورد استفاده در صنايع پزشکي و غذايي باشد.
مراجع
1. Wang W, Xu J, Fang H, Li Z, Li M. Advances and challenges in medicinal plant breeding. Plant Science. 2020;298:110573.
2. Bahmani M, Shirzad H, Majlesi M, Shahinfard N, Rafieian-Kopaei M. A review study on analgesic applications of Iranian medicinal plants. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine. 2014;7:S43-S53.
3. Rajput M, Kumar N. Medicinal plants: A potential source of novel bioactive compounds showing antimicrobial efficacy against pathogens infecting hair and scalp. Gene Reports. 2020;21:100879.
4. Hou X, Hou X, Li L. Chemical constituents from the flower buds of Daphne genkwa (Thymelaeaceae). Biochemical Systematics and Ecology. 2020;91:104055.
5. Khodadadian Z, Hassanpour-Ezatti M, Mousavi SZ, Asgarpanah J. Analgesic and anti-inflammatory potential of aerial parts of the Daphne mucronata Royle extract in mice: Opioid-independent action. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine. 2016;6(3):198-201.
6. Abolmaali SM-R, Tarkesh M, Bashari H. MaxEnt modeling for predicting suitable habitats and identifying the effects of climate change on a threatened species, Daphne mucronata, in central Iran. Ecological Informatics. 2018;43:116-23.
7. Zheng Y, Xie Q, Wang H, Hu Y, Ren B, Li X. Recent advances in plant polysaccharide-mediated nano drug delivery systems. International Journal of Biological Macromolecules. 2020;165:2668-83.
8. Zhang W, He Z, Han Y, Jiang Q, Zhan C, Zhang K, et al. Structural design and environmental applications of electrospun nanofibers. Composites Part A: Applied Science and Manufacturing. 2020;137:106009.
9. Ibrahim HM, Klingner A. A review on electrospun polymeric nanofibers: Production parameters and potential applications. Polymer Testing. 2020;90:106647.
10. Topuz F, Uyar T. Antioxidant, antibacterial and antifungal electrospun nanofibers for food packaging applications. Food Research International. 2020;130:108927.
11. Homaeigohar S, Boccaccini AR. Antibacterial biohybrid nanofibers for wound dressings. Acta Biomaterialia. 2020;107:25-49.
12. Kim JH, Lee H, Jatoi AW, Im SS, Lee JS, Kim I-S. Juniperus chinensis extracts loaded PVA nanofiber: Enhanced antibacterial activity. Materials Letters. 2016;181:367-70.
13. Aruan NM, Sriyanti I, Edikresnha D, Suciati T, Munir MM, Khairurrijal. Polyvinyl Alcohol/Soursop Leaves Extract Composite Nanofibers Synthesized Using Electrospinning Technique and their Potential as Antibacterial Wound Dressing. Procedia Engineering. 2017;170:31-5.
14. Abubakar A, Haque M. Preparation of medicinal plants: Basic extraction and fractionation procedures for experimental purposes. Journal of Pharmacy And Bioallied Sciences. 2020;12(1):1-10.
15. Hedayati M, Yazdanparast R, Fasihi H, Azizi F. Anti-tumor Activity of Daphne mucronata Extract and its Effects on TNF-a Receptors and TNF-a Release in Cultured Human Monocytes. Pharmaceutical Biology. 2003;41(3):194-8.
16. Supaphol P, Chuangchote S. On the electrospinning of poly(vinyl alcohol) nanofiber mats: A revisit. Journal of Applied Polymer Science. 2008;108(2):969-78.
17. Tian H, Yuan L, Wang J, Wu H, Wang H, Xiang A, et al. Electrospinning of polyvinyl alcohol into crosslinked nanofibers: An approach to fabricate functional adsorbent for heavy metals. Journal of Hazardous Materials. 2019;378:120751.
18. Liu B, Hu T, Yan W. Authentication of the Bilberry Extracts by an HPLC Fingerprint Method Combining Reference Standard Extracts. Molecules. 2020;25(11):2514.
19. Balouiri M, Sadiki M, Ibnsouda SK. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 2016;6(2):71-9.
20. Guimarães AC, Meireles LM, Lemos MF, Guimarães MC, Endringer DC, Fronza M, et al. Antibacterial Activity of Terpenes and Terpenoids Present in Essential Oils. Molecules. 2019;24(13).
21. Inoue M, Suzuki R, Koide T, Sakaguchi N, Ogihara Y, Yabu Y. Antioxidant, Gallic Acid, Induces Apoptosis in HL-60RG Cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 1994;204(2):898-904.
22. Dulloo AG, Seydoux J, Girardier L, Chantre P, Vandermander J. Green tea and thermogenesis: interactions between catechin-polyphenols, caffeine and sympathetic activity. International Journal of Obesity. 2000;24(2):252-8.
23. Garg A, Garg S, Zaneveld LJD, Singla AK. Chemistry and pharmacology of the citrus bioflavonoid hesperidin. Phytotherapy Research. 2001;15(8):655-69.
24. Panahi Kokhdan E, Mianabadi M, Sadeghi H, Khalaf M. The Effects of Two Species of Daphne, Betulin and Betulinic Acid on Alkaline Phosphatase Activity in Two Human Cancer Cell lines, K562 and MCF-7. yums-armaghan. 2014;18(11):900-9.
25. Zaidi A, Bukhari S, Khan F, Noor T, Iqbal N. Ethnobotanical, Phytochemical and Pharmacological Aspects of Daphne mucronata (Thymeleaceae). Tropical Journal of Pharmaceutical Research. 2015;14:1517-.
26. Ashraf I, Zubair M, Rizwan K, Rasool N, Jamil M, Khan SA, et al. Chemical composition, antioxidant and antimicrobial potential of essential oils from different parts of Daphne mucronata Royle. Chemistry Central Journal. 2018;12(1):135.
27. Li X, Kanjwal MA, Lin L, Chronakis IS. Electrospun polyvinyl-alcohol nanofibers as oral fast-dissolving delivery system of caffeine and riboflavin. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2013;103:182-8.
28. Javidnia K, Miri R, Bahri Najafi R, Khademzadeh Jahromi N. A PRELIMINARY STUDY ON THE BIOLOGICAL ACTIVITY OF DAPHNE MUCRONATA ROYLE. DARU JOURNAL OF PHARMACEUTICAL SCIENCE. 2003;11(1):28-31.
29. Talei GR, Meshkat Alsadat M, Delfan B. ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF FRUIT, LEAVES EXTRACTS OF ARTEMISIA PERSICA BOISS, RHUS CORIARIA, EPHEDRA INTERMEDIA AND DAPHNE MUCRONATA ROYLE OF LORESTAN. YAFTEH. 2004;5(18):19-23.
[1] Daphne
[2] Daphne mucronata
[3] polyvinyl alcohol
[4] Dimethyl sulfoxide (DMSO)
[5] Mueller-Hinton agar
[6] McFarland standard
[7] Minimum inhibitory concentration ) MIC)
[8] Dimethyl sulfoxide(DMSO)
[9] Minimum Bactericidal Concentration (MBC)
[10] Diameter inhibition zone
[11] Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR)
