The effect of drought stress on the efficiency of rhizobial bacteria symbiotic with faba bean Barkat variety

Mohammad hossein Arzanesh ¹ (Assistant Professor, Soil and Water Research Department, Golestan Agricultural and Natural Resources Research and Education Center , AREEO, Gorgan, Iran)

Submited date : 2023-01-17 accepted date : 2023-06-17

Keywords: Drought stress, Bean, Rhizobium, leguminosarum, nitrogen fixation efficiency,

Abstract :

In order to investigate the effect of drought stress on some growth parameters and nodulation index, the symbiotic efficiency of rhizobial isolates an experiment in controlled greenhouse conditions in the form of a completely randomized design with 21 rhizobial isolates, a negative control treatment (without rhizobial bacteria) and a control treatment Positive (no bacteria with nitrogen fertilizer at the rate of 70 mg/kg from urea source) and 3 repetitions were done in 2013. Different levels of drought stress including drought in two levels S0 (100% of field capacity (control or no drought stress)), S3 (55% of field capacity (severe stress)), which by adding different concentrations of zero and 310 grams per liter of polyethylene glycol 6000 (PEG) was applied to the nutrient solution after one week of seedling germination. The results of statistical analyzes showed that drought stress had a significant reduction effect on shoot dry weight, shoot water content, nitrogen content, symbiotic efficiency of rhizobial isolates and nodulation index.

Full-Text:



اثرتنش خشکی روی کارایی باکتری‏های ریزوبیومی همزیست (Phaseoulus vulgaris) باب علمیا رقم برکت(Rhizobium leguminosarum)

چکیده:

 به منظور بررسی اثر تنش خشکی روی برخی از پارامترهای رشدی و شاخص گره‏زایی، کارایی همزیستی جدایه‏های ریزوبیومی آزمایشی در شرایط کنترل شده گلخانه در قالب طرح کامل تصادفی با 21 جدایه ریزوبیومی، یک تیمار شاهد منفی (بدون باکتری ریزوبیومی) و یک تیمار شاهد مثبت ( بدون باکتری همراه با کود نیتروژنی به میزان 70 میلی‏گرم بر کیلوگرم از منبع اوره) و 3 تکرار در سال 1393 انجام شد. سطوح مختلف تنش خشکی شامل خشکی در دو سطح S0 (100 % ظرفیت مزرعه‎ای (شاهد یا بدون تنش))، S3  (55% ظرفیت مزرعه‎ای (تنش شدید)) که با افزودن غلظت‎های مختلف صفر و 310 گرم در لیتر پلی اتیلن گلیکول 6000 (PEG) به محلول غذایی بعد از یک هفته از سبز شدن گیاهچه­ها اعمال شد. نتایج تجزیه‏های آماری نشان داد که تنش خشکی اثرکاهشی معنی‏داری روی وزن خشک اندام هوایی، محتوای آب اندام هوایی، مقدار نیتروژن، کارایی همزیستی جدایه‏های ریزوبیومی و شاخص گره‏زایی داشت. گیاهان در شرایط تنش خشکی توانایی تشکیل گره‌های جدید را از دست می‌دهند. گره‌ها نقش مهمی در رشد و توسعه گیاهان دارند و کاهش شاخص گره‌زایی نشانگر کاهش توانایی گیاه در تولید گره‌های جدید و رشد فعال است. به‏طور کلی، نتایج نشان می‌دهد که تنش خشکی تأثیر منفی و قابل توجهی بر رشد و توسعه گیاهان، آب‌رسانی، تغذیه، همزیستی با باکتری‌های ریزوبیومی و تشکیل گره‌های جدید دارد. این نتایج می‌توانند در درک بهتر اثرات تنش خشکی بر عملکرد گیاهان و ارائه راهکارهای مناسب برای مدیریت آب در کشاورزی مفید باشند.

واژگان کليدی: باقلا، ریزوبیوم لگمینوزارم، کارآیی تثبیت نیتروژن، تنش خشکی

مقدمه:

گياه باقلا نيز در همزيستي با گونه خاصي از ريزوبيوم R. leguminosarum bv Viciae ( 2002;Weir, 2006) مي‏تواند 78 - 39 درصد از نياز نيتروژني (192 –10 کيلوگرم نيتروژن در هکتار) خود را از اين طريق تامين نمايد (Alam and Najam, 2022).

باقلا علاوه بر تامین مقدار زیادی از نیاز نیتروژنی خود باعث حاصل‏خیزی خاک می‏شود ‏(Beauchamp et al., 2001). همچنین باقلا به علت داشتن دوره نمو طولانی و دارا بودن شاخ و برگ زیاد احتیاج زیادی به آب دارد. زیرا در موقع خشکی خاک رشد ریشه‌های فرعی کم شده و گیاه خیلی زود پژمرده می‌شود و بنابراین رطوبت کافی زمین از شرایط اولیه کشت موفقیت آمیز این گیاه است. استان گلستان یکی از استان‏های مهم در زمینه کشت و تولید باقلا در سطح کشور است و اغلب باقلای کشت شده در استان به صورت دیم است، کمبود بارندگی و پراکنش نامناسب آن در برخی از سال‏ها باعث می‏شود که گیاهان کشت شده تحت تنش خشکی قرار گرفته و عملکرد آنها کاهش یابد. یکی از مهمترین دلایل کاهش عملکرد اثر تنش خشکی روی سیستم همزیستی است (Zahran, 1999;Benmoussa et al., 2022). در واقع در اغلب موارد به دلیل تنش‏های محیطی مانند خشکی، شوری و غرقاب فرایند تثبیت نیتروژن کارایی خوبی ندارد.

برخی تحقیقات نشان داده است که باکتری‌های ریزوبیوم قادر به فعال‌سازی عناصر غذایی در خاک و تحریک جذب آنها توسط گیاهان می‌باشند. این اثر می‌تواند منجر به بهبود تغذیه گیاه و افزایش عملکرد آنها شود (Gontia-Mishra et al., 2015). برخی از باکتری‌های ریزوبیوم قادر به تثبیت نیتروژن جو در ریزوسفر گیاهان می‌باشند. این فرایند به گیاهان اجازه می‌دهد تا از نیتروژن موجود در هوا استفاده کنند و این عنصر مورد نیاز را برای رشد و توسعه خود به دست آورند (Tahir et al., 2017). برخی از باکتری‌های ریزوبیوم قادر به تولید هورمون‌های گیاهی مانند اکسین‌ها و سیتوکینین‌ها هستند. این هورمون‌ها می‌توانند فرایندهای رشد و توسعه گیاهان را تنظیم کنند و بهبود عملکرد آنها را ایجاد کنند (Nadeem et al., 2014). ریزوبیوم می‌تواند به گیاهان در مقابل تنش‌های محیطی مختلف مانند تنش خشکی، شوری و بیماری‌ها کمک کند. این باکتری‌ها می‌توانند بهبود وضعیت آبی گیاهان را تسهیل کنند و به آنها کمک کنند تا با شرایط تنش مقابله کنند (Bhattacharyya and Jha, 2012). 

به‏طور مثال سطوح مختلف تنش خشکی (50، 100و 150 میلی متر تبخیر از تشتک کلاس A)، شوری خاک (25 تا 75 میلی مول)، و نیترات خاک (5 تا 10 میلی مول نیتروژن) باعث کاهش تعداد گره­ها و تثبیت نیتروژن توسط ریزوبیوم­ها روی گیاهانی مانند نخود و باقلا گردید (Borucki & Sujkowska, 2008  Guo et al., 1992;Ammar et al., 2014) همچنین تنش خشکی باعث 26 درصد کاهش احیای استیلن گردید. راموس (1999) گزارش کرد که با کاهش آب خاک تعداد و وزن گره‏ها‏، فعالیت آنزیم نیتروژناز ، پتانسیل آب برگ، مقدار پروتئین ، نشاسته و مقدار لگ هموگلوبین و فعالیت سایر آنزیم‏های مهم در ساخت کربن در گیاه لوبیا کاهش یافت. اما، وزن خشک گیاه تغییر نکرد. همچنینAlikhani  و Mohammadi (2010) نشان دادند که کارایی جدایه‏ها ریزوبیومی همزیست و نیز عملکرد گیاه عدس تحت تاثیر تنش شوری و خشکی کاهش می یابد.

تلقیح گیاهان به ویژه گیاهان خانواده حبوبات با جدایه های ریزوبیوم مقاوم به تنش خشکی می تواند راه­حل مناسبی برای کاهش اثرات تنش خشکی روی گیاهان باشند (et al., 2004 Hafeez). در اکثر مطالعات انجام شده غربالگری جدایه‏های ریزوبیومی برای مقایسه کارایی به ویژه آزمون گره زایی در شرایط غیر تنشی بررسی می­شود. هدف این مطالعه بررسی راهکاری کارامد جهت غربالگری بهتر جدایه و بررسی اثرات تنش خشکی روی شاخص های کارایی جدایه های ریزوبیومی مانند توان گره‏زایی و تثبیت نیتروژن روی یکی از ارقام های معروف باقلا یعنی رقم برکت می باشد. برای این منظور ابتدا جدایه های ریزوبیومی از گره­ها جداسازی ، خالص سازی و شناسایی مقدماتی شده و در ادامه توان گره‏زایی و کارایی همزیستی آنها در شرایط تنشی با شرایط غیر تنشی مقایسه شده و از بین آنها جدایه‏هایی که دارای شاخص‏های بالاتری هستند انتخاب شدند. 

مواد و روش ها:

1-       نمونه برداری گره از باقلا: در سال 1393 تعداد 58 نمونه گره از ریشه باقلا از سه استان گلستان ، مازندران . خراسان رضوی در مرحله اواسط گلدهی( اسفند تا اوایل فروردین) از گیاهان شاداب برداشته شد. نمونه ها بعد از برداشت و ثبت مختصات جغرافیایی (جدول 1) محل برداشت آنها در ظرف‎های مخصوص قرار داده‎شده و بلافاصله به آزمایشگاه بیولوژی خاک بخش تحقیقات خاک و آب مرکز تحقیقات و آموزش کشاورزی و منابع طبیعی گلستان منتقل شدند.

جدول1 – محل های جمع آوری گره های باقلا  

شماره نمونه	استان	آدرس محلهای نمونه بردای	مختصات جغرافيايی
1	گلستان	امیر آباد- جنب زمین زندان – روبروی تابلوی ایستگاه گرگان – نام زارع احمد بزی	N3653334	E5425130
2		ایستگاه عراقی محله – نوار مرکزی – روبروی سوله ایستگاه	N3653203	E5434518
3		سرخنکلاته- روستای کوماسی	N3652473	E5426434
4		سرخنکلاته – نرسیده به روستای الوکلاته	N3653054	E5428546
5		سرخنکلاته – سلطان آباد	N3653148	E5430229
6		سرخنکلاته – نرسیده به روستای معصوم آباد	N3653186	E5432216
7		جاده سرخنکلاته به جاده اصلی گرگان	N3652222	E5434252
8		جاده گرگان به علی آباد- سر خط مرزن کلاته	N3651464	E5435296
9		والش آباد- چاه حاج خلیل – نام زارع امید الوستانی	N3650599	E5437044
10		والش آباد- اول روستا	N3652023	E5437318
11		گرگان- نوده ملک، بعد از روستا	N3653261	E5438523
12		گرگان- بعد نوده ملک به سمت عطا آباد -حسین آباد نوده ملک	N3655157	E5438159
13		آق قلا- جنوب عطاآبادح کنار آنبار تپه	N3657265	E5437337
14		آق قلا- روستای پیر واش	N3657514	E5439514
15		علی آباد- غرب مزرعه کتول	N3657173	E5451027
16		علی آباد- جنوب امیر آباد فندرسک	N3658469	E5455103
17		علی آباد -جعفر آباد نامتلو (کیلوکتر 25 آزاد شهر)	N3658441	E5458093
18		علی آباد- شهرک دارکلاته- علی آباد کتول	N3657548	E5457128
19		گرگان- بین نوده ملک و قرق - شرق روستای جهان تیغ	N3652559	E5440233
20		گرگان- روستای مرزنکلاته	N3652060	E5436356
21		گرگان - جاده هاشم آباد	N3651089	E5421431
22		گرگان- بعد از جاده ورسن	N3650078	E5419196
23		کردکوی- روستای چهارده	N3648403	E5409504
24		کردکوی- غرب کردکوی	N3647094	E5403469
25		بندرگز- ابتدای جاده روستای کوه صحرا	N3645330	E5358370
26		بندرگز- روستای سوته ده – جاده قدیم کردکوی	N3644418	E5401427
27		کردکوی- جاده قدیم- روستای سرکلاته خراب شهر – اول امام زاده قاسم	N3645224	E5403068
28		کردکوی- سالیکنده	N3646508	E5404458
29		کردکوی- جاده قدیم - روستای زارع محله	N3647034	E5412068
30		گرگان- جاده قدیم کردکوی- روستای کفش گیری	N3648416	E5416528
1	مازندران	ساری - گیلرد	N4052424	E677596
2		ساری به بابلسر- پنبه زار کتی	N4061816	E684501
3		جویبار - گیلخواران	N4064024	E672009
4		جویبار – کوهی خیل	N4062107	E668656
5		بابلسر – نفت چال	N4063330	E662594
6		بابلسر- عرب خیل	N40662391	E656661
7		ساری – زردی جان	N4048008	E677933
8		ساری- مشهدی کلا( کشتارگاه سابق)	N4077428	E680191
9		ساری- شیخ کلا	N4047756	E679266
10		ساری- المشیر	N4044336	E674723
11		جاده ساری قائمشهر- پشت شرکت تخته فشرده	N4043472	E673785
12		ساری	N4043964	E671980
13		ساری - قائمشهر	N4041392	E673321
14		بابل- استردی کلا - روبروی ترانس برق	N4042528	E655021
15		ساری – شرف دار کلا	N4046005	E678282
16		ساری – روستای اسپندان پایین	N4068611	E688782
17		ساری – روستای اسپندان بالا	N4066858	E689129
18		جویبار- بیکار آیش	N406404	E666408
19		ساری- کشتارگاه جدید	N4049420	E675717
20		جاده قائمشهر – پایین لموک	N4042044	E673998
21		قائمشهر- روستای کاسگر	N4042069	E670381
1	خراسان رضوی	نیشابور	N668376	E4005877
2		نیشابور	N668979	E4005835
3		نیشابور	N667270	E4004990
4		نیشابور	N669446	E4006929
5		نیشابور	N669137	E4006642
6		نیشابور	N668071	E4006397
7		نیشابور	N668735	E4004270

2- جداسازی، خالص سازی و شناسایی مقدماتی: جداسازی باکتری­های ریزوبیومی از گره به روش Pii و همکاران (1994) انجام شد. آزمون­های شناسایی مانند آزمون گرم، کاتالاز، اکسیداز و آزمون های مختلف قندی طبق روش ارائه شده در کتاب طبقه بندی سیستماتیک باکتری شناسی برجی (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology) نسخه 2004 جلد دوم برای شناسایی باکتری تا حد جنس و گونه انجام شد. برای سهولت مطالعه جدایه ها بر اساس تجزیه خوشه ای به روش بیشترین شباهت با استفاده از نرم افزار Minitab نسخه 16 گروه بندی شدند.

3- آزمون گره‏زایی جدایه های ریزوبیومی(PIT¹): برای تعیین توان گره­زایی جدایه های ریزوبیومی روی ریشه­های باقلا طبق روش سوماسگران و هوبن (1994 ) با اندکی تغییرات انجام شد. برای این کار بذرهای باقلا رقم برکت از بخش اصلاح بذر و تهیه نهال مرکز تحقیقات و آموزش کشاورزی و منابع طبیعی گلستان تهیه و پس از چند بار شستشو با آب شهر به مدت 30 ثانیه در الکل 96 درجه و 5 دقیقه در محلول هیپوکلریت 5/2 درصد غوطه­ور شدند. بعد از طی این مدت بذرها 5 بار با استفاده از آب مقطر استریل شستشو و روی تشتک های پتری شیشه ای با قطر 10 سانتی متری حاوی آب-آگار (نسبت 10 به 1)  و داخل انکوباتور در دمای 20 درجه سانتی گراد قرار داده شدند.  برای کاشت از جارهای پلاستیکی (ظرف نوشابه 5/1 لیتری به ارتفاع 25 سانتی متر و قطر دهانه 9 سانتی متر) استفاده شد. این جارها با محلول 5/2 درصد هیپوکلریت سدیم ضد عفونی شدند. این جارهای پلاستیکی با مخلوط اتوکلاو شده از ماسه دو بار شسته شده و پرلیت (1تا 2 میلی متری) به نسبت 2 به 1 با ماسه پر شدند. در هر جار 5 عدد بذر جوانه زده در عمق 2 سانتی متری کاشته شد. پس از کشت هر بذر با یک میلی لیتر از سوسپانسیون باکتری با جمعیت 108×2 ریزوبیوم در هر میلی لیتر تلقیح شدند. سپس روی آن با 5/1 سانتی متر از مخلوط ماسه و پرلیت استریل پوشانده شد. جارها به اتاق رشد بخش تحقیقات خاک و آب و در دمای 5±23 درجه سلسیوس و تناوب نوری 14 ساعت روشنایی با لامپ های فلورسنت انتقال یافتند. کلیه جارها به مدت 5 روز با آب مقطر آبیاری شدند. پس از گذشت 5 روز گیاهچه های باقلا سر از بستر کشت بیرون آوردند. به منظور جلوگیری از آلودگی روی بستر و بین جوانه های باقلا با ماسه سفید شسته و استریل شده به ضخامت 5 میلی متر پوشانده شد. با ظهور برگ اصلی در بیش از 50 درصد جارها ها آبیاری گیاهان با محلول غذایی فاقد نیتروژن (Hansen and Choudhary, 2017) به مدت 8 هفته محلول غذایی (هر دو هفته) داده شدند. در پایان 8 هفته  اندام هوایی از بالای طوقه گیاه جدا و بعد از شستن ریشه ها وجود و عدم وجود گره ها ، اندازه و رنگ درون گره  برای تعیین شاحص گره‏زایی (Prevost and Antoun, 2008) ثبت گردید. در نهایت تعداد 21 جدایه که از لحاظ مورفولوژی کلنی روی پلیت  YMAمشابه ریزوبیوم و توانایی ایجاد گره روی باقلا را داشتند برای ادامه کار انتخاب شدند.

4- اثر تنش خشکی روی شاخص گره زایی، کارایی همزیستی جدایه های ریزوبیومی، وزن خشک اندام هوایی، محتوای آب اندام هوایی، مقدار نیتروژن اندام هوایی باقلا رقم برکت

برای بررسی اثر تنش خشکی روی برخی از پارامترهای رشدی و شاخص گره زایی، کارایی همزیستی جدایه های ریزوبیومی وزن خشک اندام هوایی، محتوای آب اندام هوایی، مقدار نیتروژن ، کارایی همزیستی جدایه های ریزوبیومی و شاخص گره زایی آزمایشی در قالب طرح بلوک کامل تصادفی به صورت فاکتوریل شامل، فاکتوراول کود (( مایه تلقیح باکتریایی با 21 جدایه ریزوبیومی و یک تیمار شاهد منفی ( بدون باکتری ریزوبیومی) و یک تیمار شاهد مثبت ( بدون باکتری همراه با کود نیتروژنی به میزان 70 میلی گرم بر کیلوگرم از منبع اوره)) و فاکتور دوم دو سطح تنش خشکی (بدون تنش و تنش شدید) در 3 تکرار در شرایط گلخانه ای در مرکز تحقیقات و آموزش کشاورزی و منابع طبیعی گلستان در سال 1394 انجام شد. وزن خشک اندام هوایی، محتوای آب اندام هوایی، مقدار نیتروژن، کارایی همزیستی جدایه های ریزوبیومی و شاخص گره زایی برای مقایسه بین جدایه ها اندازه گیری شدند.

شاخص گره زایی (NI) به روش پروست (2006) استفاده شد. برای این کار در پایان 8 هفته  اندام هوایی از بالای طوقه گیاه جدا و بعد از شستن ریشه ها وجود و عدم وجود گره ها ، اندازه و رنگ درون گره برای تعیین شاحص گره زایی استفاده شدند( Prevost and Antoun, 2008).

A×B×C≤18

 A= Nodule size: small 1 medium 2 large 3

 B= Nodule color: white 1 pink 2

 C=Nodule number: few 1 several 2 many 3

 

برای بررسی کارایی تبیثت نیتروژن (SE) جدایه­ها از روش Somasegaran و Hoben (1994) استفاده شد. به منظور تهیه مایه تلقیح از محیط کشت YMB به مقدار کافی و با توجه به تعداد نمونه‏ها تهیه و درون ارلن‏ها توزیع و اتوکلاو شدند. تمام جدایه های ریزوبیومی خالص سازی شده به این ارلن های استریل تلقیح و به مدت 72 ساعت روی شیکر دورانی با دوران 120 دور در دقیقه و دمای 28 درجه سلسیوس قرار داده شدند. تعداد پنج بذر جوانه‏زده در ظروف پلاستیکی (جار لئونارد) در عمق 2 سانتی متری کاشته شد. هر بذر با یک میلی لیتر از سوسپانسیون باکتری با جمعیت 108×2/1 سلول در هر میلی لیتر تلقیح شد (Somasegaran and Hoben, 1994). روی جارها با درب پلیت های استریل با قطر 10 سانتی متر برای جلوگیری از آلودگی پوشانده شد. بعد از یک هفته از سبز شدن گیاهچه های باقلا تعداد آنها به سه عدد کاهش یافت همزمان با تنک کرده گیاهچه ها محلول زیرین جارهای پلاستیکی (200 میلی لیتر) محلول غذایی فاقد نیتروژن برای لگم­های دانه درشت (Pii et al., 2015) استفاده شد. تنش خشکی شدید ( 55 % ظرفیت مزرعه ای) با استفاده از غلظت 310 گرم در لیتر پلی اتیلن گلیکول 6000 اعمال شد (Alizadegan et al., 2015; Abdi et al., 2014). سـطوح مختلـف خشـکی بـا پلـی اتـیلن گلیکـول (6000) اعمال گردید. غلظـت پلـی اتـیلن گلیکـول کـه بـراي تهیـه پتانسیل آب لازم بود از طریق رابطه زیر بدست آمد. 

QS= (1018×10-2) C-(1018×10-4) C2 + (2067×10-4) CT+ (8039×10-7) C2T

QS: پتانسیل اسمزي بر حسب بار 

C :غلظت پلی اتیلن گلیکول بر حسب گرم در لیتر

 T :درجه حرارت بر حسب درجه سانتی گراد

برای این منظور محلول های غذایی هر دو هفته  با محلول های غذایی جدید پر شدند. این جارهای حاوی گیاهچه در شرایط گلخانه ای مشابه با شرایط قبل (آزمون گره زایی) تا مرحله اولیه گل‏دهی (8 هفته) نگهداری شدند. در طول دوره رشد ازمحلول غذایی عناصر کم مصرف و پر مصرف (بدون نیتروژن) استفاده شد. تیمار نتیروژنی به مقدار 70 میلی گرم در کیلوگرم به فرم اوره و به صورت تقسیط در 4 مرحله و هر مرحله به میزان 5/17 میلی گرم در کیلوگرم به ترتیب در 1، 3،5 و 7 هفتگی استفاده شد.در انتهای 8 هفته اندام هوایی از محل طوقه جداسازی و در داخل پاکت های کاغذی به مدت سه روز در دمای 68 درجه سلسیوس قرار داده شدند. پس از گذشت این مدت وزن خشک اندام هوایی اندازه گیری و کارای همزیستی با استفاده از فرمول زیر تعیین گردید

SE= (Ti-Tc)/ (Tn-Tc) ×100

 که در این معادله SE کارایی همزیستی جدایه ریزوبیومی در شرایط تنش خشکی، Ti وزن خشک اندام هوایی گیاه تلقیح شده با جدایه ی ریزوبیومی، Tc وزن خشک اندام هوایی در تیمار شاهد منفی (تلقیح نشده و کود داده نشده) و Tn وزن خشک اندام هوایی در تیمار شاهد مثبت (تلقیح نشده و کود داده شده) بودند. در ضمن به منظور مقایسه میزان نیتروژن در تیمارهای آزمایشی مقدار نیتروژن موجود در اندام هوایی به وسیله دستگاه کجدال اندازه گیری شد. در ارزیابی کارایی همزیستی اکر 50 SE< بود جدایه در طبقه با کارایی ضعیف، SE-50-75 در طبقه با کارایی متوسط و SE- 75-100 در طبقه با کارایی خوب و SE>100 در طبقه با کارایی خیلی خوب گروه بندی شدند (1994  Somasegaran and Hoben,).

براي اندازه گيري محتواي نسبي آب (RWC) در ساعت 10 صبح از آخرين برگ توسعه يافته (برگ سوم انتهایی) به طور تصادفي نمونه­برداري انجام شد. برگ هاي جدا شده از هر بوته به طور جداگانه در كيسه هاي پلاستيكي قرار داده شد و براي جلوگيري از تلفات آب، نمونه­ها روي تكه­هاي يخ به سرعت به آزمايشگاه منتقل و وزن تر آنها اندازه­گيري شد.سپس برگ ها در آب مقطر به مدت 24 ساعت در دماي اتاق و نور كم براي محاسبه وزن اشباع غوطه­ور شدند و پس از اين مدت نمونه­ها بسرعت و با دقت با دستمال كاغذي خشك و وزن اشباع آنها اندازه گيري شد. نهايتاً براي اندازه­گيري وزن خشك، نمونه ها را به مدت24 ساعت در دماي 70 درجه سانتيگراد در آون قرار داده شد، و RWC طبق معادله زیر تعیین گردید(Ritchie et al., 1990 ؛et al., 2004 Creus).

RWC= (وزن خشک – وزن اشباع /وزن خشک – وزن تر) × 100

نتایج:

1-جداسازی ریزوبیوم‏ها از گره،  شناسایی و دسته بندی و آزمون گره‏زایی 

تعداد 21 جدایه ریزوبیومی که 10 جدایه از گره های باقلا در استان های خراسان رضوی (40/16 درصد)، 8 جدایه از گره های گلستان ( 11/12 در صد )و 3 جدایه ( 92/4 در صد ) از مازندران جداسازی شدند. از 21 جدایه ریزوبیومی همزیست با باقلا، تعداد 16 جدایه قادر به استفاده از ساکارز به عنوان منبع کربنی بودند و 5 جدایه نیز توانایی مصرف ساکارز را نداشتند. تعداد 15 جدایه توانایی رشد در pH برابر 9 و همه جدایه ها توانایی رشد در محیط با pH برابر با 8 را داشتند. همه جدایه ها گرم منفی،میله ای، هوازی متحرک و کلنی های آنها اغلب دایره ای ،محدب ، برآمده ،لعابی نیمه مات ، فاقد توان جذب کنگورد با قطر کلنی دو تا 4 میلی متر پس از پنج روز بودند.  شناسایی مقدماتی بر اساس کتاب برجی (1994) نشان داد که همه جدایه های ریزوبیومی منسوب به گونه ریزوبیوم لگمینوزاروم ²بودند. گروه بندی جدایه های ریزوبیومی وجود 10 گروه فرعی را بر اساس تفاوت در صفات بیوشیمیایی و فیزویولوژیک نشان داد( شکل1). در گروه اول بیشترین تعداد جدایه ها یعنی 7 جدایه قرار داشت. در گروه دوم سه جدایه و در 4 گروه بعدی هر کدام 2 جدایه ریزوبیومی داشتند. در نهایت نیز سه گروه وجود داشت که تنها یک جدایه در آن قرار داشتند( شکل1).

 

شکل1- تجزیه خوشه ای  جدایه های ریزوبیوم لگومینوزاروم همزیست با باقلا

بررسی وضعیت گره بندی ( فراوانی ، اندازه و رنگ داخل گره­ها) جدایه های ریزوبیومی همزیست با باقلا نشان داد که بین جدایه ها از این لحاظ تفاوت وجود داشت. در نتیجه شاخص گره زایی برای هر جدایه با جدایه دیگر تفاوت داشت. نتایج بررسی شاخص گره بندی جدایه های مختلف بر اساس نتایج آزمون آلودگی گیاه در جدول 1 آورده شده است.

جدول1-  بررسی ضریب گره زایی در جدایه های ریزوبیومی همزیست با باقلا  

جدایه ها ریزوبیومی	محل های جدا سازی	تعداد گره	اندازه گره ها	رنگ داخل گره	شاخص گره زایی(NI3)
Rlu01	گلستان	3	3	2	18
Rlu02	گلستان	2	3	2	12
Rlu03	گلستان	1	2	2	4
Rlu04	گلستان	2	2	2	8
Rlu05	گلستان	1	2	2	4
Rlu06	گلستان	2	3	2	12
Rlu07	گلستان	3	3	2	18
Rlu08	گلستان	2	3	2	12
Rlu09	خراسان رضوی	2	2	2	8
Rlu10	خراسان رضوی	3	1	2	6
Rlu11	خراسان رضوی	2	1	2	4
Rlu12	خراسان رضوی	2	1	2	4
Rlu13	خراسان رضوی	2	3	2	12
Rlu14	خراسان رضوی	2	2	2	8
Rlu15	خراسان رضوی	3	3	2	18
Rlu16	خراسان رضوی	1	2	2	4
Rlu17	خراسان رضوی	2	2	2	8
Rlu18	خراسان رضوی	2	1	2	4
Rlu19	مازندران	1	2	2	4
Rlu20	مازندران	3	3	2	18
Rlu21	مازندران	1	2	2	4

از لحاظ دسته بندی بر اساس شاخص گره زایی این 21 جدایه به 5 دسته متفاوت تقسیم شدند(جدول2) که از لحاظ تعداد بین دسته ها تفاوت وجود داشت( جدول2). جدایه های  Rlu01 ، Rlu07 ، Rlu15 و Rlu20 دارای ضرایب گره زایی بالاتری از بقیه جدایه ها بودند.  جدایه ها در شرایط بدون تنش دارای شاخص گره زایی از 4 تا 18 بودند. 

جدول2- دسته بندی جدایه های ریزوبیومی بر اساس شاخص گره زایی

شاخص گره زایی	تعداد جدایه ها	جدایه های ریزوبیومی
4	8	Rlu03 ، Rlu05 ، Rlu011 ، Rlu12، Rlu16 ، Rlu18، Rlu19 و Rlu21
6	1	Rlu10
8	4	Rlu04 ، Rlu09 ، Rlu14 ، Rlu17
12	4	Rlu02 ، Rlu06 ، Rlu08 ، Rlu13
18	4	Rlu01 ، Rlu07 ، Rlu15 ، Rlu20

همچنین از لحاظ کارایی تثبیت نیتروژن  در شرایط بدون تنش خشکی این 21 جدایه به 4 دسته متفاوت تقسیم شدند که بین دسته ها از لحاظ تعداد تفاوت وجود داشت (جدول3).

جدول3- دسته بندی جدایه های ریزوبیومی بر اساس کارایی تثبیت نیتروژن  در شرایط بدون تنش خشکی 

شاخص گره زایی	تعداد جدایه ها	جدایه های ریزوبیومی
I	1	Rlu17
E	13	Rlu13 ، ، Rlu012 ، Rlu11، Rlu09 ، Rlu08، Rlu05، Rlu04 ،Rlu03 ، Rlu02 ، Rlu01 Rlu21 ، Rlu19 ، Rlu16،
PE	4	Rlu06 ، Rlu10 ، Rlu14 ، Rlu18 ، Rlu07
VE	3	Rlu07 ، Rlu15 ، Rlu20 ، Rlu06 ، Rlu08 ، Rlu09 ، Rlu19

 

4-اثر تنش خشکی روی شاخص گره زایی، کارایی همزیستی جدایه های ریزوبیومی، وزن خشک اندام هوایی، محتوای آب اندام هوایی، مقدار نیتروژن اندام هوایی باقلا رقم برکت: نتایج تجزیه واریانس ماده خشک کل، گره بندي و صفات وابسته به آن، مقدار نیتروژن تثبیت  شده در گره و عملکرد تثبیت نیتروژن ، تحت تاثیر سطوح مختلف تنش خشکی و سطوح مختلف تلقیح با جدایه های ریزوبیوم لگومینوزاروم در جدول 4 نشان داده شده است . تاثیر تیمار خشکی و تیمار تلقیح جدایه های ریروبیومی واثر متقابل سطوح خشکی و جدایه های ریزوبیومی روی صفات اندازه گیری شده معنی دار بود (جدول 4). 

جدول4- نتایج تجزیه واریانس گره بندی و صفات وابسته به آن، مقدار نیتروژن ، وزن خشک اندام هوایی و ریشه

شاخص گره زایی	محتوای نسبی آب	کارایی  همزیستی	میزان نیتروژن اندام هوایی	وزن خشک اندام هوایی	درجه آزادی	منبع تغییرات
**13/789	**62/12530	**93/33748	**22/392898	**15/121	1	تنش خشکی
**48/1763	**77/485	**20/77512	**38/3111215	**23/26	22	تیمار تلقیح
**87/692	**55/206	**97/6903	**83/27826	**63/7	22	اثر متقابل
01/24	67/92	61/6	83/5673	94/5	92	خطا
83/8	22/1	41/6	687/6	996/10	-	ضریب تغییرات(%)

** و ns به ترتیب معنی داری در سطح 1 درصد و عدم وجود اختلاف معنی دار

نتایج حاصل از این صفت کارایی همزیستی جدایه های ریزوبیومی نشان داد که در شرایط بدون تنش 3/14 درصد جدایه در گروه خیلی موثر، 62 درصد در گروه جدایه های موثر و 19 درصد در گره جدایه های نسبتاً موثر و 8/4 درصد در گروه جدایه های غیرموثر قرار داشتند (شکل6). 

اثر تنش شدید خشکی روی وزن خشک اندام هوایی، مقدار نیتروژن و شاخص گره زایی در تیمارهای تلقیج شده با جدایه های ریزوبیومی تفاوت داشتند. نتایج حاصل از مقایسه میانگین داده ها نشان داد که مقدار نیتروژن گیاهچه ها در تیمارهای تلقیح شده با جدایه های Rlu07 ، Rlu15  و Rlu20  تفاوت کمتری نسبت به تیمار شاهد مثبت ( تیمار نیتروژنی ) داشتند.

یکی دیگر از اثرات تنش خشکی کاهش وزن خشک اندام هوایی یود. بیشترین وزن خشک اندام هوایی در شرایط تنش خشکی شدید مربوط به جدایه Rlu15  بود. همچنین مقدار نیتروژن ،  تعداد گره و مقدار تثبیت نیتروژن اندام هوایی در گیاهچه های تلقیح شده با این جدایه نسبت به شاهد بیشتر بود.. در این آزمایش بیشترین میزان نیتروژن تثبیت شده مربوط به جدایه های ریزوبیومی Rlu07 ، Rlu15  و Rlu20  و کمترین مقدار مربوط به تیمار شاهد (C) بود ( شکل های 2،  و 4).

اعمال تنش خشکی باعث کاهش وزن خشک اندام هوایی، مقدار نیتروژن اندام هوایی، درصد نیتروژن تثبیت شده ، درجه کارایی، درجه گره زایی و محتوای نسبی آب در برگ شد.

 

 

 

 

شکل 2– اثر تنش خشکی روی وزن خشک اندام هوایی باقلا رقم برکت 

 

شکل 3– اثر تنش خشکی روی مقدار نیتروژن اندام هوایی باقلا رقم برکت

 

یکی دیگر از اثرات تنش خشکی کاهش کارایی جدایه ای ریزوبیومی بود.نتایج حاصل از این تحقیق نشان داد که در صورت اعمال تنش خشکی شدید تعداد جدایه های با کارایی بالا و خوب کاهش یافته و غربالگری بهتر برای انتخاب جدایه های مقاوم و کارا صورت می گیرد. در کل کارایی جدایه های با توانایی موثر 46 درصد کاهش یافت. علاوه بر کارایی همزیستی جدایه ها در اثر افزایش تنش خشکی گروه بندی جدایه های ریزوبیومی نیزتغییر کرد و جدایه ها غیر موثر بیشتر شدند. به طوری که جدایه های با کارایی خیلی موثر به صفر درصد، گروه با کارایی موثر به 8/23 درصد، گروه با کارایی نسبتاموثر به 3/33 درصد و گروه ریزوبیومی با کارایی غیر موثر به 9/43 درصد تغییر یافتند (شکل4). سه جدایه با کارایی بالا (Rlu07، Rlu15 و Rlu20) با  اعمال تنش خشکی، یک درجه کاهش کارایی همزیستی در آنها مشاهده گردید. کلاس کارایی این سه جدایه از خیلی موثر به موثر کاهش یافت (شکل 4). 

 

 

شکل4– اثر تنش خشکی روی کارایی همزیستی باقلا رقم برکت

 

شکل 5– اثر تنش خشکی روی محتوای نسبی آب اندام هوایی باقلا رقم برکت 

بررسی محتوای نسبی آب در گیاهچه های تلقیح شده با جدایه های ریزوبیومی  بیشتر از تیمار شاهد بود (شکل 5). یکی دیگر از اثرات تنش خشکی کاهش شاخص گره زایی در ریشه های تلقیح شده بود (شکل 6)، به طوری که نیمی از جدایه­ها دارای شاخص گره زایی پایین تر از 4 شدند. 

 

شکل6 – اثر تنش خشکی روی شاخص گره زایی باقلا رقم برکت 

در شرایط تنش خشکی از لحاظ دسته بندی بر اساس شاخص گره زایی این 21 جدایه به 3 دسته متفاوت تقسیم شدندکه از لحاظ تعداد بین دسته ها تفاوت وجود داشت(جدول5). جدایه های  Rlu07 ، Rlu10 ، Rlu15 و Rlu20 دارای ضرایب گره زایی بالاتری از بقیه جدایه ها بودند.  جدایه ها در شرایط بدون تنش دارای شاخص گره زایی از 2 تا 8 بودند.

جدول5- دسته بندی جدایه های ریزوبیومی بر اساس شاخص گره زایی  در شرایط تنش شدید

شاخص گروه زایی	تعداد جدایه ها	جدایه های ریزوبیومی
2	11	Rlu01 ، Rlu02 ، Rlu03 ، Rlu06، Rlu11 ، Rlu12، Rlu13، Rlu14، Rlu16،  Rlu17 و Rlu18
4	6	Rlu21 ، Rlu19 ، Rlu09 ، Rlu08 ، Rlu05 ، Rlu04
8	4	Rlu07 ، Rlu10 ، Rlu15 ، Rlu20

از لحاظ کارایی تثبیت نیتروژن  در شرایط تنش خشکی این 21 جدایه به 3 دسته متفاوت تقسیم شدند که بین دسته ها از لحاظ تعداد تفاوت وجود داشت ( جدول6).

جدول6- دسته بندی جدایه های ریزوبیومی بر اساس کارایی تثبیت نیتروژن  در شرایط تنش شدید

شاخص کارایی	تعداد جدایه ها	جدایه های ریزوبیومی
I	9	Rlu01 ، ، Rlu03 ، Rlu10، Rlu11 ، Rlu12، Rlu13، Rlu14، Rlu17 و Rlu18
E	5	Rlu21 ، Rlu20 ، Rlu16 ، Rlu15 ، Rlu07
PE	7	Rlu02 ، Rlu04 ، Rlu05 ، Rlu06 ، Rlu08 ، Rlu09 ، Rlu19

 

بین جذب نیتروژن و وزن خشک اندام هوایی گیاهان تلقیج شده با جدایه های ریزوبیوم همبستگی بیشتری در حالت تنش شدید نسبت به شرایط بدون تنش مشاهده شد( شکل7).  Lerkiو Akhgar (2014) به وجود رابطه بین جذب نیتروژن و وزن خشک اندام هوایی تاکید داشتند. بر اساس میانگین داده ها بیشترین وزن خشک اندام هوایی با در گیاهان تلقیج شد با جدایه های Rlu07، Rlu15  وRlu20  (بالاترین غلظت نیتروژن) بدست آمد.

 

A

 

 

B

 

شکل7 – رابطه بین مقدار نیتروژن در اندام هوایی و وزن خشک اندام هوایی در شرایط بدون تنش( A) و در شرایط تنش خشکی شدید  (B)

 

بحث:

استفاده از جدایه مناسب باکتری ريزوبيومي و تلقيح آن مي تواند مقدار زيِادی از نياز نيتروژني باقلا را برطرف نمايد. لذا اولين مرحله از کار جداسازی و بررسي کارايي اين جدايه ها و سپس انتخاب جدايه ها با کارايي بالاست . نتايج حاصل از اين تحقيق نشان داد که 34 در صد از نمونه­های گره، واجد ريزوبيوم وقابل جدا سازی با روش معمول بودند. از 58 نمونه گره ريشه ای باقلا 21جدایه توانايی ايجاد گره روی ريشه های باقلا را داشتند. گاهی اوقات طولانی شدن زمان نگهداری باکتری روی لوله های حاوی محيط کشت مورب (اسلنت) تا آزمون گره زايی ،کشت های متوالی حين فرايند خالص سازی (واکشت‏ها) ممکن است ، باعث از دست رفتن پلازميدهای حاوی ژن nod ، که نقش اصلی را در فرايند گره زايی دارند، شده باشد (Laguerre et al., 2003).

صفت کارایی همزیستی یک معیار مهم در انتخاب جدایه های ریزوبیومی است که بیانگر توانایی تثبیت نیتروژن در گیاهان گره دار شده می باشد (2004 Somasegaran and Hoben,). در اتیوپی از 38 جدایه تنها 13 درصد جدایه‏ها (5 جدایه) در گروه با کارایی خیلی موثر و 71 درصد (27 جدایه) جدایه ها در گروه با کارایی موثر (خوب) قرار داشتند.  افزایش وزن خشک ساقه و ریشه در اثر تلقیح (یونجه و شبدر) با جدایه های ریزوبیومی همانند کارهای Lerki و Akhgar (2014) مطابقت داشت. البته میزان افزایش نیتروژن نسبت به شاهد در این آزمایش به دلیل اعمال تنش خشکی کمتر بود. در واقع گیاه در حالت تنشی انرژی زیادی را صرف بقای خود می‏کند.

همانند نتایج آین آزمایش Farnia و همکاران (2007) به نقل از Hafiz و همکاران (2000) گزارش کردند که جدایه هاي باکتري ریزوبیوم لگومینوزارم اثر معنی داري بر وزن خشک گره عدس دارند و اعمال تنش رطوبتی تأثیر معنی‏داري روي این صفت می‏گذارد. همچنین دانشیان (1374) در مطالعه روي اثر متقابل جدایه هاي باکتري ریزوبیوم (هلی نیترو، گلدکت و ریزوکینگ) و ارقام مختلف سویا (ویلیا مز، سنچوري و هارکور) به اثر معنی دار جدایه  باکتري تحت تاثیر عوامل محیطی اشاره نمود که در این بین جدایه گلدکت از گره زایی بیشترينسبت به سایر جدایه ها برخوردار بود. Farnia و همکاران (2007) نیز در بررسی اثر تنش خشکی بر گره بندی و تثبیت نیتروژن سه کود زیستی هلی نیترو، ریزوکنیک و نیتراژین روی سویا نشان داد که باکتری موجود در کود زیستی هلی نیترو در شرایط مطلوب آبیاری مقدار تثبیت نیتروژن، ماده خشک بالاتری نسبت به بقیه کودهای زیستی داشت. در حالی که با اعمال تنش خشکی کود زیستی ریزوکینگ از کارایی بیشتری برخوردار بود و تعداد گره فعال بیشتر ، تثبیت نیتروژن بیشتر و در نتیجه ماده خشک بالاتری را تولید نمود. در نتیجه آنها کود زیستی هلی نیترورا برای حالت بدون تنش خشکی و کود زیستی ریزوکینگ را برای شرایط تنش خشکی پیشنهاد دادند. با توجه به نتایج حاصل از این سه شاخص جدایه های با بیشترین مقدار یعنی جدایه های ریزوبیومی Rlu07، جدایه Rlu15 و جدایه Rlu20 انتخاب شدند. 

مقايسه کارايي جدايه ها می تواند براساس ميزان نيتروژن جذب شده توسط گياه و یا مقایسه وزن خشک اندام هوایی صورت گیرد. اندازه گيری میزان نیتروژن اندام هوایی مطابق نظر Fesenko و همکاران (1995) نسبت به اندازه گيری وزن خشک اندام هوايي مناسب تر است. برخی دیگر از محققین نیز اندازه گیری وزن خشک اندام هوایی را موثرتر از اندازه گیری نیتروژن در اندام هوایی می‏دانند (Khosravi, 2014; Lerki and Akhgar, 2014). در این آزمايش نیز اندازه‏گیری میزان نیتروژن اندام هوایی و وزن خشک اندام هوايي هردو انجام شد و نتایج حاصل نشان داد که 48 درصد جدایه ها دارای کارایی غیر موثر، 33 درصد موثر و تنها 19 درصد خیلی موثر بودند.علل این کمی کارایی ممکن است به علت مصرف کودهای نیتروژنی، حضور جمعیت بومی ریزوبیوم های غیرکارا یا کم کارا وشرایط محیطی باشد.

توان تثبیت نیتروژن و تولید ماده خشک گیاه، تحت تاثیر عوامل مختلفی از قبیل ژنوتیپ گیاه، جدایه  باکتري، رطوبت خاك، نیتروژن طبق نظر Serraj و همکاران (1999)، در بین ریزوبیوم ها جدایه های تند رشد به از دست دادن رطوبت بیشتر از جدایه های کند رشد حساس هستند (Serraj et al., 1999). اما بقای ریزوبیوم ها در خاک تحت تنش خشکی مهم نیست. تکثیر و حرکت ریزوبیوم هادر خاک های خشک می تواند عامل محدود کننده خصوصاً در مراحل اولیه ایجاد رابطه همزیستی باشد که این امر می تواند باعث کاهش فرایند آلوده‏سازی شود. (Serraj et al., 1999).   

همچنین تنش خشکی نیز یکی دیگر از عوامل مهم درفرایند تثبیت نیتروژن است (Chammakhi, 2022). کافی نبودن آب از دو طریق فعالیت گره ها را کاهش و یا متوقف می کند، یکی اثر غیرمستقیم تنش خشکی است که در مراحل اولیه باعث کاهش فتوسنتز گیاه می‏شود، زیرا روزنه ها بسته شده و کاهش ورود دي اکسیدکربن به برگ باعث کاهش فعالیت فتوسنتزي گیاه می‏گردد، چنانچه این شرایط به مدت طولانی ادامه یابد انتقال کربوهیدرات ها به گره ها کاهش می‏یابد، که دلیل آن کاهش میزان تولید مواد فتوسنتزي و هم چنین مصرف مواد فتوسنتزي جهت رشد و توسعه ریشه به منظور دستیابی به منابع جدید آب، می باشد. این عامل باعث کاهش تثبیت نیتروژن شده و با کاهش نیتروژن مورد نیاز گیاه، فرایند تولید و توسعه برگ ها و اندام هاي رویشی کند می شود که خود منجر به کاهش فتوسنتز گیاه می‏گردد و در تنش سخت این عامل تشدید می‏گردد. همچنین اثر مستقیم تنش خشکی بر تثبیت نیتروژن، از طریق کاهش انتشار اکسیژن به گره و در نتیجه کاهش تنفس گره است (Elbagory, 2022). با توجه به این که تثبیت نیتروژن واکنشی انرژي خواه می باشد، محدودیت تولید انرژي در گره هاي موجود بر روي ریشه، تثبیت نیتروژن را کاهش می دهد. نتایج آزمون کارایی 21 جدایه‏های ریزوبیومی تثبیت کننده بیولوژیکی نیتروژن در تنش خشکی شدید نشان داد که ضریبت گره زایی در جدایه‏ها از 56 تا 89 درصد و کارایی تثبیت نیتروژن از 10 تا 50 درصد کاسته می شود. در واقع ضریب گره زایی نسبت به کارایی حساسیت بیشتری به تنش خشکی دارد. Serraj و همکاران (1999) کاهش تعداد گره و وزن خشک را بعد از اعمال تنش شدید خشکی گزارش کردند (Serraj et al., 1999). 

 

خشکی باعث کاهش تجمع نیتروژن و کاهش عملکرد در لگم­ها می­شود. این کاهش به دلیل کاهش فعالیت نیتروژناز است که خود به دلایلی مانند محدودیت یا کاهش منایع کربن، کاهش اکسیژن و بازخورد خود تنظیمی حاصل از تجمع نیتروژن در اندام های هوایی باشد. تغییر در جریان آب در آوند آبکش باعث تغییر در فشار تورژسانس در برگ ها شده که این امر خود باعث تغیر شدید در فعالیت گره‏ها می‏شود. از طرفی اثر تنش خشکی جریان سیگنال نیتروژن همراه با تجمع نیتروژن در ساقه و گره‏ها را باعث می‏شود که خود می‏تواند باعث ممانعت از تثبیت نیتروژن در مراحل اولیه در خاک‏های خشک شود. وجود تفاوت‏های ژنتیکی رقم‏ها امکان افزایش تثبیت نیتروژن و مقاومت به شرایط خشکی را فراهم می‏کند.

بر اساس نتایج به‏دست آمده، مقدار نیتروژن اندام هوایی و ماده خشک اندام هوایی می‏تواند به‏عنوان معیار مناسب برای مقایسه کارایی جدایه‏ها مورد استفاده قرار گیرد. هم چنین معیار تعداد و وزن خشک گره همبستگی مثبت و معنی‏دار با میزان نیتروژن اندام هوایی دارند، در صورتی که وزن تر و خشک ریشه  معیار مناسبی به شمار نمی‏آید و از این فاکتور نمی‏تواند جهت تعیین کارآیی جدایه باکتري برتر استفاده نمود ( جدول7).

 

جدول7- ضریب همبستگی بین صفات اندازه گیری شده

صفات اندازه گیری شده	1	2	3	4	5	6	7	8
محتوانی  نسبی آب(1)	000/1
وزن تر اندام هوایی(2)	*556/0	000/1
وزن خشک اندام هوایی(3)	0727/0**	890/0**	000/1
وزن تر  ریشه(4)	789/0**	672/0**	796/0**	000/1
وزن خشک  ریشه(5)	316/0*	609/0*	606/0**	497/0**	000/1
میزان نیتروژن اندام هوایی(6)	495/0**	931/0**	880/0**	652/0**	664/0**	000/1
تعداد گره در بوته(7)	380/0**	891/0**	780/0*	560/0**	659/0**	956/0**	000/1
وزن خشک  گره دربوته(8)	386/0**0	881/0**	790./0*	594/0**	686/0**	960/0*	940/0**	000/1

**. Correlation is significant at the 0.01 level

*. Correlation is significant at the 0.05 level

 

Farnia و همکاران (2007) نیز تعداد گره و نه اندازه گره را معیار مناسبی برای توان تثبیت جدایه های ریزوبیومی بیان کردند. همچنین در آزمایش گلخانه‏ای روی یونجه تحت شرایط کم آبی مشاهده کردند که وزن گیاه و مقدار نیتروژن در گیاهان تلقیح شده با جدایه­های ریزوبیوم میلیلوتی در شرایط خشک بیشتر بود (Serraj et al., 1999). افزایش مقدار نیتروژن تثبیت شده تقریبا به طور خطی مقدار ماده خشک تولید شده را افزایش داد که خود به دلیل تولید سطح فتوسنتزکننده بیشتر و تولید و انتقال مواد فتوسنتزي بیشتر به ریشه می باشد و این خود می‏تواند بر تثبیت نیتروژن اثر تشدید کننده داشته باشد (Farnia et al., 2007; Khosravi, 2014; Lerki and Akhgar, 2014). 

با اعمال تنش خشکی مقدار تثبیت نیتروژن و ماده خشک در گیاهانی از قبیل سویا، باقلا، نخود و نخود فرنگی کاهش می یابد(Farnia et al., 2007). کاهش تثبیت نیتروژن در جدایه هاي مختلف باکتري تحت تاثیر سطوح تنش خشکی و به خصوص در تنش شدید می‏تواند عمدتاً مربوط به آنزیم موجود در برگ باشد که مسئول تجزیه محصولات تثبیت نیتروژن انتقال یافته از گره‎ها به برگ‏ها می‏باشد این آنزیم داراي حساسیت زیادي نسبت به کمبود آب است و فعالیت آن دچار اختلال می گردد، با کاهش فعالیت این آنزیم، اثر بازخوردي منفی روي فعالیت تثبیت نیتروژن دارد، در نتیجه تثبیت نیتروژن کاهش می‎یابد، اما مکانیسم آن به‏طور کامل مشخص نشده است. دلیل دیگري که می توان علت کاهش تثبیت نیتروژن با کاهش رطوبت خاك را توجیه نمود، کاهش تنفس سلول هاي ریشه و مخصوصا تنفس گره‏هاي موجود روي ریشه می‏باشد، با کاهش تنفس گره، انرژي مورد نیاز تثبیت نیتروژن کاهش می یابد و سبب کاهش تثبیت نیتروژن می‏گردد. کاهش بیش از 20 درصد رطوبت گره، سبب توقف تثبیت نیتروژن می‏گردد و تنفس گره را به شدت کاهش می دهد، هم چنین تغییرات روزانه قابل توجهی در میزان تثبیت نیتروژن به وسیله گره سویا در رابطه با تغییرات مقدار رطوبت گزارش شده است (Farnia et al., 2007). به‏نظر می‏رسد که کاهش تثبیت نیتروژن در اثر خشکی گره، مربوط به کاهش تنفس گره به دلیل کمبود اکسیژن در باکتري ها می­باشد، چنین کمبودي در اثر ایجاد یک مانع فیزیکی در ورود اکسیژن به گره به وجود می آید که در اثر بی‏میلی لگ هموگلوبین گره خشک نسبت به اکسیژن پدید می‏آید. این نظریه با توجه به این که اثرات منفی کمبود ر طوبت بر تثبیت نیتروژن و تنفس گره با افزایش غلظت اکسیژن در اطراف گره برطرف می‏شود مطرح می‏گردد (Farnia et al., 2007). تنش خشکی ملایم باعت کاهش تثبیت نیتروژن گردید، اما در تنش هاي متوسط و شدید، تثبیت نیتروژن کاهش شدیدي را نشان داد. به‏نظر می‏رسد کمبود رطوبت در حد متوسط سبب تغییرات ساختمانی از قبیل پارگی پلاسمودسماتا در بخش خارجی سلول هاي کورتکس گره هاي سویا می شود، این خسارت نه تنها در اثر تعرق بیش از حد گره به دلیل خشکی هواي خاك، بلکه در اثر جذب مواد مضر مانند نمک هاي در تماس با ریشه ایجاد می گردد (Farnia et al., 2007).

 

 نتیجه گیری کلی:

با کاهش میزان آب در برگ (محتوای نسبی آب) در اثر تنش خشکی مقدار نیتروژن اندام هوایی و وزن خشک اندام هوایی کاهش یافت. به‎طوری که با کاهش هر یک درصد میزان آب در اندام هوایی مقدار نیتروژن 5/1 درصد و مقدار عملکرد (وزن خشک اندام هوایی) به میزان 6/1 درصد کاهش می‏یابد. لذا در هنگام استفاده از مایه تلقیح‏های ریزوبیومی باید از جدایه‏های مقاوم به تنش خشکی استفاده نمود. در این تحقیق نیز اثر سطح تنش خشکی شدید روی برخی از اجزای اصلی سیستم همزیستی بررسی شد و در نهایت از بین 21 جدایه، سه جدایه Rlu07، Rlu15 و Rlu20 از گونه Rhizobium leguminosarun دارای مقدار بیشتری نیتروژن و وزن خشک اندام هوایی بودند به‏عنوان جدایه‏های مقاوم گزارش شدند.  

 

منابع:

Abdi, H., Bihamta, M., Azizof. E., and Chogan, R. (2013). Investigating the levels of drought stress caused by polyethylene glycol (PEG 6000) on the components of seed rejuvenation and its relationship with drought tolerance indices in promising varieties and lines of bread wheat (Triticum aestivum L) Iranian Agricultural Research, 14(4): 582-596.

Alam, T., and Najam, L. (2022). Faba-Bean Antioxidant and Bioactive Composition: Biochemistry and Functionality. In Faba Bean: Chemistry, Properties and Functionality, (pp. 123-162). Springer, Cham.

Alikhani, H. A., Mohammadi, L. (2009). Investigating the salinity and drought tolerance of lentil symbiotic rhizobial isolates in rainfed conditions. Plant production technology, 10(1): 59-68.

Alizadegan, A., Hosseini Sarqin, S., and Jameei, R. (2014). investigating the effect of drought stress on antioxidant compounds in fava bean plant (Vicia faba), the second scientific research conference of biology and horticultural sciences of Iran, Tehran.

Ammar, M. H, F., Anwar, E. H., El-Harty, H. M., Migdadi, S. M., Abdel-Khalik, S. A., Al-Faifi, M., and Farooq and Alghamdi S. S. (2014). Physiological and yield responses of faba bean (Vicia faba L.) drought in a Mediterranean-type Environment. J Agro Crop Sci, 201: 280–287.

Beauchamp, C. J., Kloepper, J. W., Shaw, J. J. and Chalifour, F. P. (2001). “Root colonization of faba bean (Vicia faba L.) and pea (Pisum sativum L.) by Rhizobium leguminosarum bv. viciae in the presence of nitrate-nitrogen,” Canadian Journal of Microbiology, 47(12): 1068–1074. doi: 10.1139/cjm-47-12-1068.

Benmoussa, S., Nouairi, I., Rajhi, I., Rezgui, S., Manai, K., Taamali, W., Abbes, Z., Zribi, K., Brouquisse, R. and Mhadhbi, H. (2022). Growth Performance and Nitrogen Fixing Efficiency of Faba Bean (Vicia faba L.) Genotypes in Symbiosis with Rhizobia under Combined Salinity and Hypoxia Stresses. Agronomy, 12(3): p.606.

Bhattacharyya, P. N., and Jha, D. K. (2012). Plant Growth-Promoting Rhizobacteria (PGPR): Emergence in Agriculture. World J Microbiol Biotechnol, 28(4): 1327-50.

Borucki, W., and Sujkowska, M. (2008). The effects of sodium chloride-salinity upon growth, nodulation, and root nodule structure of pea (Pisum sativum L.) plants. Acta Physiologiae Plantarum, 30(3): 293-301.

Burlyn, E., Michela and Merrill R. and Kaufmann (1973). The osmotic potential of polyethylene glycol 6000. Plant Physiol, 51: 914-916.

Chammakhi, C., Boscari, A., Pacoud, M., Aubert, G., Mhadhbi, H., and Brouquisse, R. (2022). Nitric Oxide Metabolic Pathway in Drought-Stressed Nodules of Faba Bean (Vicia faba L.). International Journal of Molecular Sciences, 23(21): p.13057.

Creus, C. M., Sueldo, R. J., and Barassi, C. A. (2004). Water relations and yield in Azospirillum-inoculated wheat exposed to drought in field.Can. J. Bot. 82: 273–281.

Creus, C. M., Sueldo, R. J., and Barassi, C. A. (1998). Water relations in Azospirillum -inoculated wheat seedlings under osmotic stress. Can. J. Bot. 76: 238–244.

 

Elbagory, M., El-Nahrawy, S., and Omara, A. E. D. (2022). Synergistic Interaction between Symbiotic N2 Fixing Bacteria and Bacillus strains to Improve Growth, Physiological Parameters, Antioxidant Enzymes and Ni Accumulation in Faba Bean Plants (Vicia faba) under Nickel Stress. Plants, 11(14): p.1812.

 

Farnia, A., Noormohammadi, Q., and Naderi, A. (2007). Effect of drought stress on nodulation and nitrogen fixation of different races of Rhizobium japonicum in soybean. A new find in agriculture. second year, 2: 132-149.

Fesenko, A. N., Provorov, N. A., Orlova, I. F., Orlov, V. P., and Simarov, B.V. (1995). Selection of Rhizobium leguminosarum bv. viceae strains for inoculation of Pisum sativum L. cultivars: analysis of symbiotic efficiency and nodulation competitiveness. Plant Soil, 172: 189–198.

Gontia-Mishra, I, Sapre, S., Sharma, A., and Tiwari, S. (2015). Effect of plant growth-promoting Bacillus sp. on growth, antioxidant enzymes and DNA content of tomato seedlings under salt stress. Springerplus, 4:130

Guo, R., Silsbury, H., and Graham, R. D. (1992). Effect of four nitrogen compounds on nodulation and nitrogen fixation in faba bean, white lupine and medic plants. Australian Journal of plant physiology, 19: 501-508.

Hafeez, F. Y., Safdar, M. E., Chaudhury, A. U., and Malik, K. A. (2004). Rhizobial inoculation improves seedling emergence, nutrient uptake and growth of cotton. Australian Journal of Experimental Agriculture, 44: 617-622.

Hansen, A. P., and Choudhary, D. K. (2017). Rhizobium Biology and Biotechnology. doi: 10.1007/978-3-319-64982-5.

Joseph, B., Patra, R. R., and Lawrence, R. (2007). “Characterization of plant growth promoting rhizobacteria associated with chickpea (Cicer arietinum L.),” International Journal of Plant Production, 1(2): 141–151 ST–Characterization of plant growth pro.

Khosravi, H. (2014). Investigating some physiological characteristics of Rhizobium leguminosarum bv.viciae native to Iran. Journal of Cellular and Molecular Research (Iranian Journal of Biology), 28(4): 513-523.

Laguerre, G., Louvrier, P., Allard, M. R., and Amarger, N. (2003). Compatibility of rhizobial genotypes within natural populations of Rhizobium leguminosarum biovar viciae for nodulation of host legumes. Applied and Environmental Microbiology, 69: 2276–2283.

Lalande, R., Blowaneza, P. C., Antoun, H. (1990). Symbiotic effectiveness of strains of Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli from soils of Rawanda.Plant and Soil, 121: 41-46.

Lerki, S., and Akhgar, A. R. (2014). Effect of Sinorhizobium bacteria on growth, nodulation and nitrogen fixation in fenugreek plant. Journal of Soil Biology, 2(2): 137-148.

Nadeem, S. M., Ahmad, M., Zahir, Z. A., Javaid, A., and Ashraf, M. (2014). The role of mycorrhizae and plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) in improving crop productivity under stressful environments. Biotechnol Adv, 32(2): 429-48

Pii, Y., Mimmo, T., Tomasi, N., Terzano, R., Cesco, S., and Crecchio, C. (2015). Microbial interactions in the rhizosphere: beneficial influences of plant growth-promoting rhizobacteria on nutrient acquisition process. A review. Biology and Fertility of Soils, 51(4): 403-415.

Prevost, D., and Antoun, H. (2008). Root nodule bacteria and symbiotic nitrogen fixation. In: Carter MR, Gregorich EG (eds), Soil sampling and methods of analysis (2nd edn). Boca Raton: CRC Press, 379–397.

Ramos, M. L. G., Gordon, A. G., Minchin, F. R., Sprent, J. I. and Parsons, R. (1999). Effects of water stress on nodule physiology and biochemistry of a drought tolerant cultivar of common bean (phaseolus vulgaris L.). Annals of Botany, 83(1): 57-63.

Ritchie, S. W., Nguyen, H. T., and Holaday, A. S. (1990). Leaf water content and gas exchange parameters of two wheat genotypes differing in drought resistance. Crop Sci, 30: 105-111.

Saghafi, D., Alikhani, H. A., and Motsharazadeh. (2013). Investigating plant growth stimulating properties of some rhizobial bacteria isolated from Iranian soils. Journal of Soil Management and Sustainable Production, 4(2): 131-150.

Serraj, R., Sinclair, T. R., Purcell, L. E. (1999). Symbiotic N2 fixation response to drought. Journal of Experimental Botany, 50:143-155.

Somasegaran, P., and Hoben, H. (1994). Handbook for rhizobia: methods in legume-Rhizobium technology. Springer Science & Business Media

Suarez, R.; Wong, A., Ramirez, M., Barraza, A., Orozco, M., Cevallos, M., Lara, M., Hernandez, G., and Iturriaga, G. (2008). Improvement of drought tolerance and grain yield in common bean by overexpressing trehalose-6- phosphate synthase in rhizobia. Molecular plant microb interactions. Published by APS PRESS in cooperation with the International Society for Molecular Plant-Microbe Interactions, 21(7): 958-966.

Tahir, M., Mirza, M. S., Zaheer, A., Dimitrov, M. R., Smidt, H., and Hameed, S. et al. (2017). Synergistic Effects of Biochar and Plant Growth-Promoting Rhizobacteria on the Growth and Physiology of Oryza sativa L. Front Plant Sci, 8:162.

Vacheron, J., Desbrosses, G., Bouffaud, M. L., Touraine, B., Moënne-Loccoz, Y., and Muller, D. et al. (2013). Plant growth-promoting rhizobacteria and root system functioning. Front Plant Sci. 2013;4:356

Weir, B. (2006). Systematics, Specificity, and Ecology of New Zealand Rhizobia (Doctoral dissertation, The University of Auckland New Zealand).

 

 

 

 

 

The effect of drought stress on the efficiency of rhizobial bacteria symbiotic with faba bean Barkat variety

Abstact:

In order to investigate the effect of drought stress on some growth parameters and nodulation index, the symbiotic efficiency of rhizobial isolates an experiment in controlled greenhouse conditions in the form of a completely randomized design with 21 rhizobial isolates, a negative control treatment (without rhizobial bacteria) and a control treatment Positive (no bacteria with nitrogen fertilizer at the rate of 70 mg/kg from urea source) and 3 repetitions were done in 2013. Different levels of drought stress including drought in two levels S0 (100% of field capacity (control or no drought stress)), S3 (55% of field capacity (severe stress)), which by adding different concentrations of zero and 310 grams per liter of polyethylene glycol 6000 (PEG) was applied to the nutrient solution after one week of seedling germination. The results of statistical analyzes showed that drought stress had a significant reduction effect on shoot dry weight, shoot water content, nitrogen content, symbiotic efficiency of rhizobial isolates and nodulation index.

 

Key words: Bean, Rhizobium leminosarum, Nitrogen fixation efficiency, Drought stress

 

 

9

 

---

[1]  PIT (plant-infection test)

[2]  (R.leguminosarum(Rlu)

[3] 3Nodulartion Index (Prevost and Antoun,2006): A×B×C≤18 A(Nodule size: small 1 medium 2 large 3), B(Nodule color: white 1 pink 2) and C(nodule number : few 1 several 2 many 3)

---