Investigation of Triterpenic Acid Diversity in jujube Ziziphus jujuba mill. from Various Habitats in Iran

zhaleh khoshsima ¹ (1Department of Analytical Chemistry, Faculty of Chemistry, Islamic Azad University, North Tehran Branch, Tehran,Iran) Amir Abdolah Mehrdad Sharif ² (Department of Analytical Chemistry, Faculty of Chemistry, Islamic Azad University, North Tehran Branch, Tehran, Iran)
Ahmad Akrami ³ (Department of Analytical Chemistry, Faculty of Chemistry, Islamic Azad University, North Tehran Branch, Tehran,Iran)

Submited date : 2023-04-10

Keywords: Betulinic acid, Oleanolic acid, Ursolic acid, ultrasonic wave, hierarchical cluster analysis,

Abstract :

Triterpenic acids, specifically Betulinic, Oleanolic, and Ursolic acids, are essential bioactive compounds found in jujube Ziziphus jujuba mill. fruit, possessing therapeutic properties for various diseases, including cancer. However, the amount of these triterpenic acids can vary depending on geographical and cultivation conditions. For this purpose, jujubes grown in orchards of 29 different habitats from east, northeast, south, center, and west in different provinces of Iran were sampled at the end of the summer season. The triterpenic acids present in the dried jujube powder were extracted using 96% ethanol as a solvent, with a liquid-to-solid ratio of 15 mL/g, under ultrasonic waves at a temperature of 40 ℃ for 35 minutes. The extracted acids were quantified using high-performance liquid chromatography coupled with a UV detector. The obtained data were subjected to subsequent nested analysis and the Tukey test. The results revealed that only the average amount of betulinic acid significantly varied among the ecotypes. Furthermore, a hierarchical cluster analysis based on the diversity of these three triterpenic acids divided the studied ecotypes into four clusters. Cluster 1, representing Iran's eastern and northeastern regions, exhibited the highest amount of these triterpenic acids. However, analysis of variance between the clusters showed no significant difference among them. The results of the statistics show that the Climatic conditions, soil quality,seed and agricultural methods can be effective in changing or not changing the amount of triterpenic acids in jujube.

Full-Text:



 

1726- 2th revise 4.4.1402

لطفا دقت بفرمایید و اصلاحات جدید را با هایلایت مشخص نمایید

بررسی تنوع اسیدهای تری ترپنیک موجود در عناب.Ziziphus jujuba mill از رویشگاه‌های مختلف ایران

چکیده

اسیدهای تری ترپنیک به خصوص  اسید بتولینیک، اسیداولئنولیک و اسید اورسولیک به عنوان اجزای زیست فعال مهم در میوه عناب.Ziziphus jujuba mill دارای خواص درمانی در بسیاری از بیماریها از جمله  سرطان می باشند. اما مقادیر این اسید های تری ترپنیک ممکن است در شرایط جغرافیایی و کشت متفاوت، یکسان نباشند. بدین منظور، از عناب کشت شده در باغات مربوط به 29 رویشگاه متفاوت از شرق، شمال شرق، جنوب، مرکز، و غرب در استان های مختلف ایران در اواخر فصل تابستان  نمونه‌برداری گردید. با استفاده از الکل 96 درصد به عنوان حلال و با نسبت مایع به جامد 15 میلی‌لیتر بر گرم تحت امواج فراصوت با دمای 40 درجه سانتیگراد، زمان امواج دهی 35 دقیقه اسید تری ترپنیک های موجود در پودر عناب خشک استخراج و سپس به روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا همراه با آشکار ساز ناحیه مرئی و ماورای‌بنفش اندازه‌گیری شده اند. پس از آن تجزیه تحلیل آشیانه ای و آزمون توکی بر روی داده های بدست آمده انجام شد، که نتایج نشان داد، فقط مقدار میانگین اسید بتونیلیک  بین اکوتیپ ها تفاوت معنی داری دارد. همچنین  مطابق تجزیه و تحلیل خوشه‌ای سلسله مراتبی بر اساس میزان تنوع این سه اسید تری ترپنیک، اکوتیپ های مورد مطالعه  به چهارخوشه تقسیم‌بندی گردید و نتایج نشان داد،  خوشه 1 که مربوط به مناطق شرق و شمال شرق ایران بوده حاوی بیشترین مقدار این سه اسید تری ترپینیک ها است، در مقابل تجزیه تحلیل واریانس بین خوشه ها نشان می دهد که  تفاوت معنی داری بین آنها وجود ندارد. نتایج حاصل از آمار نشان داد که شرایط اقلیمی ، کیفیت خاک ، بذر و نحوه کشاورزی می تواند در تغییر یا عدم تغییر مقدار اسید تری ترپنیک ها  در عناب تاثیر گذار باشد.

 

واژه‌های کلیدی: اسید بتولینیک، اسیداولئنولیک، اسید اورسولیک، امواج فراصوت، تحلیل خوشه‌ای.

 

Investigation of Triterpenic Acid Diversity in jujube Ziziphus jujuba mill. from Various Habitats in Iran

Abstract

Triterpenic acids, specifically Betulinic, Oleanolic, and Ursolic acids, are essential bioactive compounds found in jujube Ziziphus jujuba mill. fruit, possessing therapeutic properties for various diseases, including cancer. However, the amount of these triterpenic acids can vary depending on geographical and cultivation conditions. For this purpose, jujubes grown in orchards of 29 different habitats from east, northeast, south, center, and west in different provinces of Iran were sampled at the end of the summer season. The triterpenic acids present in the dried jujube powder were extracted using 96% ethanol as a solvent, with a liquid-to-solid ratio of 15 mL/g, under ultrasonic waves at a temperature of 40 ℃ for 35 minutes. The extracted acids were quantified using high-performance liquid chromatography coupled with a UV detector. The obtained data were subjected to subsequent nested analysis and the Tukey test. The results revealed that only the average amount of betulinic acid significantly varied among the ecotypes. Furthermore, a hierarchical cluster analysis based on the diversity of these three triterpenic acids divided the studied ecotypes into four clusters. Cluster 1, representing Iran's eastern and northeastern regions, exhibited the highest amount of these triterpenic acids. However, analysis of variance between the clusters showed no significant difference among them. The results of the statistics show that the Climatic conditions, soil quality,seed and agricultural methods can be effective in changing or not changing the amount of triterpenic acids in jujube.

 

Keywords: Betulinic acid, Oleanolic acid, Ursolic acid, ultrasonic wave, hierarchical cluster analysis

مقدمه

عناب .Ziziphus jujubamill یکی از معروف ترین گیاهان قرون گذشته بوده که به خواص منحصر به فرد آن در سال های اخیر بیشتر پی برده شده است. میوه عناب حاوی مقادیر زیادی ویتامین و مواد معدنی، اسیدهای تری ترپنیک¹، ساپونین ها² و جوجوبوزید³ است که باعث شده ارزش غذایی بالایی داشته باشد. اسیدهای تری ترپنیک به خصوص اسید بتونیلیک(BA) ، اسید اولئنولیک (OA) و اسید اورسولیک (UA) در میوه عناب از ترکیبات فعال زیستی اصلی است، که دارای اثرات دارویی کاربردی در درمان سرطان، یبوست، اضطراب و بی خوابی می باشند و در طب سنتی از عناب برای درمان آلرژی، اضطراب، افسردگی، دیابت، اسهال، خشکی پوست، خستگی، فشار خون بالا ، بی خوابی، تعریق شبانه، درد، تنگی نفس و استرس استفاده می شود(Jahan et al., 2022, Bhopi  et al., 2022,  Ruan et al., 2023 ).

مقدار ترکیبات زیست فعال مانند اسیدهای تری ترپنیک در عناب می‌تواند تحت‌تأثیر عواملی مانند زمین کشت، محیط جغرافیایی، شرایط فرآوری و شرایط نگهداری باشد. تفاوت بین ترکیبات شیمیایی عناب در رویشگاه‌های مختلف می‌تواند تبدیل به چالشی در اصلاح و کاشت انواع عناب و ارزیابی و استانداردسازی کیفیت محصول به‌دست‌آمده از آن شود(Song et al., 2020 ). ازاین‌رو بررسی مقدار اسیدهای تری ترپنیک در عناب‌های مناطق مختلف برای صنعت داروسازی جهت مصارف دارویی بسیار مهم است. روش‌های مختلفی برای استخراج اسید تری ترپنیک ها مطرح شده است که بیشتر روش استخراج به کمک امواج فراصوت⁴ برای استخراج اسید تری ترپنیک ها از عناب و سایر گیاهان استفاده شده                                                    است(Wen et al., 2018, Hortas et al., 2018, Fu et al., 2014,  Wei and Yang, 2014).  

 همچنین جهت تعیین مقدار این اسیدها روش‌های متعددی معرفی شده که در این میان روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا(HPLC) به دلیل آسانی، دقیق بودن در اغلب موارد استفاده شده است (Wua et al., 2015, Peng and Liu,  2010). 

  اما تا کنون مطالعه جامع بر طبق مقادیر BA، OA و UA برای عناب ایرانی با درنظرگرفتن انواع رویشگاه‌ها انجام نشده است: باتوجه ‌به این موضوع اهداف این تحقیق عبارت است از: بررسی تنوع این اسیدهای تری ترپنیک  اصلی در عناب از رویشگاه‌های مختلف ایران با کمک تحلیل واریانس⁵ (ANOVA) و خوشه ای سلسله مراتبی⁶(HCA) می باشد.

 

مواد و روش‌ها

نمونه

انواع عناب‌های خشک مناطق مختلف ایران  مربوط به اواخر فصل تابستان سال 1400 هجری شمسی از جمله شمال (جویبار)، شمال شرق (گرگان، چشمه آق سو، تپه صوفیان، کلاله، کردکوی)، جنوب (بافت، دوسیران، کازرون)، غرب (الیگودرز، ازنا، چال سرا، ایلام، درود)، شرق (بیرجند، سربیشه، قاین، درمیان، نهبندان، فردوس، سرایان)، مرکز (ساوه، خمین، دلیجان، تفرش، جعفرآباد، قم، خلجستان ودهاقان)  خریداری شد. نمونه‌ها آسیاب و در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شدند.

مواد و معرف‌ها 

استانداردهای  BA OA و UA از شرکت سیگما آلدریچ و متانول کروماتوگرافی، سدیم پرکلرات و آنتراسن از شرکت مرک میلی پور خریداری شدند. اتانول 96 درصد از شرکت الکل کیمیا زنجان خریداری شده و آب خالص با استفاده از سیستم تصفیه آب اولترا Aquaplus در محل انجام آزمایش تهیه و در نهایت فیلتر نایلونی (0.45 میکرومتر) از میلی پور خریداری شده است.

استانداردها و روش تهیه آنها

 محلول‌های استاندارد BA، OA، UA و آنتراسن به‌عنوان استانداردهای داخلی با حل‌کردن مقدار مناسبی از آنها در الکل 96 درصد تهیه شده تا غلظت نهایی 45/0 میلی‌گرم در میلی‌لیتر برای آنتراسن و 2/0 میلی‌گرمی بر میلی‌لیتر برای اسیدهای تری ترپنیک مذکور به دست آید. 5 سری رقت با کمک محلول‌های ذخیره استاندارد به‌صورت مخلوط هر سه اسید تری ترپنیک ها در غلظت‌های بین 0/16 تا 0/25 میکروگرم بر میلی‌لیتر برای BA، 0/10 تا 0/15 میکروگرم در میلی‌لیتر برای OA، و 0/10 تا 0/17 میکروگرم در میلی‌لیتر برای UA همراه با 2 میکروگرم در میلی‌لیتر آنتراسن به‌عنوان استاندارد داخلی تهیه شدند. 

استخراج به روش امواج فرا صوت

برای استخراج و تهیه عصاره حدود 666 میلی‌گرم از نمونه‌ها (29 نوع عناب از رویشگاه‌های مختلف) به طور دقیق توزین و به یک لوله سانتریفیوژ منتقل شد و 10 میلی‌لیتر اتانول 96 درصد حجمی بر حجم به آن اضافه شد (نسبت مایع به جامد 15 میلی لیتر برگرم) و در دستگاه امواج فراصوت (D.S.A. China)، با فرکانس: 40 کیلوهرتز در مدت‌زمان 35 دقیقه و دمای 40 درجه سانتی‌گراد استخراج شدند. سپس محلول‌های استخراج شده از طریق فیلترهای نایلونی 45/0 میکرومتر صاف شده و به یک بالون ژوژه 10 میلی‌لیتری منتقل شدند. در نهایت با استفاده از اتانول در حضور 2 میکروگرم بر میلی‌لیتر آنتراسن به‌عنوان استاندارد داخلی به حجم رسانده شدند. 

اندازه‌گیری به روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا

کلیه محلول‌های استاندارد و نمونه‌ها به سیستم کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (Kenuar Azura) مجهز به پمپ چهارتایی، گاز زد، با محفظه ستون و یک آشکارساز مرئی و فرابنفش (UV)  تک طول‌موج تزریق گردید. ستون کروماتوگرافی مورداستفاده MN Nucleodur C18 gravity (250mm×4/6 mm, 5 µm) همراه با پیش ستون MN C18 guard column. (10mm×4/6 mm, 5 µm) بوده است. فاز متحرک متشکل از متانول و بافر پرکلرات سدیم 2 دهم درصد وزنی حجمی با نسبت 88 به 12 بوده که قبل از استفاده از طریق فیلتر 45/0 میکرومتر (نایلون) و سیستم خلأ صاف و گاز زدا شده، سرعت جریان 5/0 میلی‌لیتر در دقیقه بوده و طول‌موج تشخیص روی 210 نانومتر تنظیم شد. دمای ستون در 22 درجه سانتی‌گراد ثابت نگه داشته شده و حجم تزریق 50 میکرولیتر بود. 

ضرایب همبستگی منحنی‌های کالیبراسیون بعد از تزریق در دستگاه کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا بعد از محاسبات بیش از 99/0 بود. حد تشخیص (LOD) و حد کمیت سازی (LOQ) برای این سه اسید تری ترپنیک با کمک از منحنی کالیبراسیون محاسبه شد و به ترتیب مطابق ذیل است. (08/1 میکروگرم بر میلی‌لیتر برای BA، 72/0 میکروگرم بر میلی‌لیتر برای OA و 42/0میکروگرم بر میلی‌لیتر برای UA) و (27/3 میکروگرم بر میلی‌لیتر برای BA، 17/2 میکروگرم بر میلی‌لیتر برای OA و7 2/1میکروگرم بر میلی‌لیتر برای UA). 

با کمک مساحت پیک به‌دست‌آمده از استاندارد داخلی در محلول سه‌تایی استاندارد کلیه مساحت پیک‌های سایر محلول‌های استاندارد و نمونه‌ها نرمالیزه شده و با درون‌یابی از منحنی کالیبراسیون مقدار هر کدام از اسیدها بر حسب میکروگرم بر گرم پودر خشک عناب به‌دست‌آمده است. شکل 1 کروماتوگرام محلول استاندارد و محلول عصاره عناب را نشان می‌دهد.

 

الف

ب

شکل 1 کروماتوگرام محلول استاندارد (الف) و محلول عصاره عناب (ب)  ترتیب خروج پیک‌ها: (1) آنتراسن (2) اسید بتولینیک (3) اسیداولئنولیک (4) اسید اورسولیک

 

محاسبات آماری

تجزيه و تحلیل واریانس جهت بررسی و مقایسه میزان تنوع اسید تری ترپنیک ها بر اساس موقعیت جغرافیایی بین استان ها و داخل استان های مورد مطالعه 29 اکوتیپ عناب مورد مطالعه به روش نستد و آزمون توکی با کمک نرم افزار گراف پد Prism نسخه 9 انجام شد. در این مطالعه  همچنین شباهت این 29 اکوتیپ عناب مطابق با مقادیر BA ، OA و UA به‌دست‌آمده  و بر اساس موقعیت جغرافیایی طبق روش خوشه‌بندی تجمعی به‌عنوان یک رویکرد پایین‌به‌ بالا با کمک نرم افزار مینی تب 2016 گروهبندی ‌شده‌ وسپس با کمک تحلیل واریانس یک طرفه تفاوت بین خوشه درسطح احتمال 05/0 مورد بررسی قرار گرفت.

نتایج

مقادیر BA، OA و UA از عصاره عناب 29 اکو تیپ با اندازه‌گیری به روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا  به‌دست‌آمده و در جدول 1 بر طبق استان‌ها و مناطق مختلف ایران به طور خلاصه نمایش‌داده‌شده است.

جدول 1. مقادیر اسید تری ترپنیک ها بر حسب میکروگرم بر گرم  BA، OA و UA در 29 اکوتیپ عناب

مقادیر اسید تری ترپنیک ها بر حسب میکروگرم بر گرم			منطقه	نام استان
UA	OA	BA
195/84±56/0a	169/52±92/0a	83/303 ±86/0a	بیرجند	خراسان جنوبی
180/25±84/0a	175/81±96/0a	23/285±52/0a	سربیشه
6/195±92/0a	9/168±94/0a	02/300±45/0a	قائن
23/174±947/0a	23/185±86/0a	45/323±68/0a	درمیان
56/185±82/0a	52/190±56/0a	56/302±78/0a	نهبندان
52/196±44/0a	45/162±84/0a	25/274±89/0a	فردوس
89/174±68/0a	25/200±54/0a	25/293±92/0a	سرایان
58/174±62/0a	25/180±63/0ab	28/175±95/0bcd	الیگودرز	لرستان و ایلام
23/165±94/0a	25/230±85/0ab	23./180±82/0bcd	ازنا
85/170±58/0a	96/195±95/0ab	45/165±85/0bcd	درود
56/198±92/0a	23/210±92/0ab	56/200±65/0bcd	چالسرا
25/198±86/0a	23/185±96/0ab	32/168±29/0bcd	ایلام
85/150±59/0a	62/195±93/0ac	32/220±59/0bef	ساوه	مرکزی و قم و اصفهان
89/165±49/0a	56/190±84/0ac	26/200±58/0bef	خمین
23/155±63/0a	56/120±94/0ac	47/250±98/0bef	دلیجان
96/145±54/0a	26/135±87/0ac	63/195±95/0bef	تفرش
26/130±89/0a	26/90±92/0ac	26/175±96/0bef	جعفر آباد
62/153±26/0a	52/142±96/0ac	26/170±63/0bef	قم
56/123±36/0a	74/155±95/0ac	78/155±58/0bef	خلجستان
28/170±59/0a	23/185±85/0ac	58/143±84/0bef	دهاقان
56/180±92/0a	69/175±84/0abcd	56/170±84/0ceh	بافت	کرمان و فارس
56/123±96/0a	23/150±92/0abcd	32/165±58/0ceh	دوسیران
23/165±98/0a	45/170±56/0abcd	45/185±74/0ceh	کازرون
26/179±62/0a	94/187±45./0abd	52/230±72/0adfh	کردکوی	گلستان و مازندران
36/220±65/0a	23/195±56/0abd	23/289±78/0adfh	گرگان
96/250±98/0a	36/200±58/0abd	56/290±84/0adfh	چشمه اق سو
56/230±96/0a	63/250±59/0abd	45/278±86/0adfh	تپه صوفیان
65/180±87/0a	2/165±56/0abd	21/226±65/0adfh	جویبار
84/195±83/0a	30/200±92/0abd	42/265±58/0adfh	کلاله

داده‌ها میانگین مقدار ± انحراف استاندارد (SD) را نشان می‌دهد (n = 3).

در هر ستون میانگین هاي داراي حداقل يک حرف مشترک، تفاوت آماري معني داري مطابق با آزمون توکی در سطح آماري 5 درصد ندارند.

 

جدول 2. تجزیه واریانس نستد (آشیانه ای)

منابع تغییرات	BA		OA		UA
	واریانس	انحراف استاندارد	واریانس	انحراف استاندارد	واریانس	انحراف استاندارد
بین استان ها	*4/369	87/20	*00/0	00/0	ns 6/131	47/11
بین اکوتیپ ها در داخل استان ها	*6/435	22/19	2/695ns	37/26	ns0/333	25/18

ns و *به ترتیب غیر معني دار و معني داربودن درسطح احتمال 5 درصد ميباشند.

 

مطابق مقادیر بدست آمده در جدول 1 تحلیل واریانس آشیانه ای بین اکوتیپ ها در داخل استانها و بین استان ها انجام شده و نشان می دهد که مقدار BA در مناطق داخل استان ها و بین استان ها تفاوت معنی داری داشته و مقدارOA فقط بین استان ها تفاوت معنی داری دارد و همچنین مقدار UA  در اکوتیپ های داخل استان ها و بین استان ها تفاوت معنی داری ندارد. به منظور درک بهتر از تشابه بین اکوتیپ های استان های مختلف آزمون توکی نیز انجام گردیده (جدول 1) و مشاهده شد، مقدار  BA  در استان خراسان جنوبی فقط با استان گلستان و مازندران(شمال) و  مقدار OA  نیز در استان خراسان جنوبی با تمامی استان های مورد مطالعه و مقدار UA نیز در تمامی استان ها تفاوت معنی داری در سطح آماری 5 درصد ندارند.

تحلیل واریانس نمی‌تواند دسته‌بندی مفیدی با اطلاعات کامل و طبقه‌بندی‌شده  داشته باشد حتی اگر تمامی پارامترهای اندازه‌گیری شده در نظر گرفته شده باشد. در این راستا تجزیه‌وتحلیل خوشه سلسله‌مراتبی یک ابزار کاربردی برای کشف شباهت بین اجزای مختلف با درنظرگرفتن انواع پارامترها و شرایط است. باید در نظر گرفت که در تحلیل واریانس شباهت بین رویشگاه‌های مختلف نشان داده می‌شود درحالی‌که در تجزیه تحلیل خوشه‌بندی سلسله‌مراتبی تفاوت بین گروه‌ها مشخص می شود که به‌عنوان یک ابزار کاربردی برای کشف شباهت بین اجزای مختلف در یک گروه می باشد.

به همین دلیل در این مطالعه، گروه‌بندی مطابق با HCA بر اساس مقدار BA، OA و UA نیز انجام شد که نتیجه آن تقسیم بندی 4 خوشه ای این 29 اکوتیپ عناب می باشد که در شکل 2 به طور کامل نمایش‌داده‌شده است. همچنین میانگین مقادیر BA، OA  و UA برحسب میکروگرم بر گرم همراه با تعداد اکو تیپ ها نیز در هر خوشه مشخص و در جدول 3 فهرست شده است.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                                    شکل 2. تجزیه‌وتحلیل خوشه‌ای سلسله‌مراتبی(HCA) 29 نوع عناب از رویشگاه‌های مختلف ایران

 

جدول 3. مقادیر میانگین بر حسب میکروگرم بر گرم BA ، OA، و UA در خوشه‌های مختلف.

متغیرها	تعداد اکوتیپ ها	BA	OA	UA
خوشه 1	11	826/292	951/189	333/197
خوشه 2	7	444/174	580/192	041/175
خوشه 3	6	543/245	808/175	083/174
خوشه 4	5	450/172	802/134	392/135

 

 

 

 

 

 

 

 

 

جدول 4. نام اکوتیپ ها در هر خوشه

خوشه 4	خوشه 3	خوشه 2	خوشه 1
تفرش	ایلام	الیگودرز	بیرجند
قم	کلاله	بافت	قائن
خلجستان	ساوه	کازرون	فردوس
دوسیران	کردکوی	درود	سربیشه
جعفر آباد	جویبار	دهاقان	نهبندان
	دلیجان	ازنا	سرایان
		چالسرا	درمیان
			خمین
			گرگان
			چشمه آق سو
			تپه صوفیان

 

 

بر اساس HCA، 29 اکوتیپ عناب در ایران به چهار خوشه طبقه‌بندی شدند، مطابق با جدول شماره 3، مقدار میانگین BA در خوشه 1 بیشترین مقدار و در خوشه 4 کمترین مقدار به ترتیب برابر با 826/292 میکروگرم برگرم و 450/172 میکروگرم برگرم می باشد. مقدار میانگین OA در خوشه 2 بیشترین مقدار برابر با 580/192 میکروگرم بر گرم و خوشه 4 کمترین مقدار میانگین برابر با 802/134 میکروگرم بر گرم را داراست. مقدار میانگین UA  نیز در خوشه 1 بیشترین مقدار برابر با 333/197میکروگرم بر گرم را دارد. همچنین خوشه 4  نیز کمترین مقدار UA برابر با 392/135 میکروگرم برگرم را داراست. 

با توجه به جدول شماره 4 که نام شهر های هر خوشه در آن نشان داده شده است، می توان به این نتیجه رسید که خوشه 1  با 11 اکو تیپ  بیشتر مربوط به مناطق شرق و شمال شرق ایران بوده، خوشه 2 شامل 7 اکوتیپ متعلق به مناطق غرب، جنوب و مرکز ایران، خوشه 3 با 6 اکوتیپ متعلق به غرب، مرکز و شمال و شمال شرق ایران و خوشه 4 با 5 اکوتیپ متعلق به مرکز ایران می باشد. 

همچنین برای تشخیص تفاوت معنی دار بین خوشه ها تحلیل واریانس یک طرفه انجام شد.جدول شماره5 نتایج تحلیل را نشان می دهد. 

 

                                         جدول 5. تحلیل واریانس یک طرفه خوشه ها

منابع تغییرات	مجموع مربعات	درجه آزادی	مقدار P (p-value)
داخل خوشه ها	1382	8	1447/0
بین خوشه ها	3297	3

 

مطایق جدول تفاوت معنی داری بین مقادیر این سه اسید تری ترپنیک در خوشه های مربوطه وجود ندارد.

بحث

 نتایج تحلیل واریانس آشیانه ای در جدول 2 و آزمون توکی مطابق با جدول 1 مشخص می کند  مقدار میانگین BA در بین استان ها تفاوت معنی داری دارد این بدان معناست که تغییر در مقدار آن تحت تاثیر شرایط اقلیمی و موقعیت جغرافیایی است. از طرفی با توجه به اینکه مقدار BA مطابق با نتایج واریانس آشیانه ای در داخل استان ها (جدول2) نیز متفاوت است می توان به این نتیجه رسید که شرایط خاک ، بذر و نحوه کشاورزی در مناطق مختلف استان تاثیر گذار می باشد.  Vilkickyteو  Raudone (2021) در مطالعه ای در زمینه  اثرات فنولوژیکی و جغرافیایی بر محتوای فنولی و تری ترپنوئیدی برگ های مورد صحرایی قرمز  Vaccinium vitis-idaea L. با نتایج آماری نشان دادند که شرایط آب و هوایی  بر محتوای اسید تری ترپنیک ها و ترکیبات دیگر تاثیر گذار می باشد، بطوریکه شرایط سخت محیطی و سازگاری با سرما تأثیر مثبتی بر محتوای بیشتر ترکیبات دارد، بنابراین برگ‌های مذکور باید ترجیحاً در طول پاییز تا نیمه اول بهار جمع‌آوری شوند و همچنین تغییر شرایط درشت مغذی‌ها و کیفیت خاک، نور، دما و رطوبت نیز باید برای بهبود مقادیر ترکیبات فنولی و تری ترپنوئیدی مورد استفاده قرار گیرند. Song و همکاران (2020) هم در بررسی و اندازه گیری تری ترپنوید کل در عناب جمع آوری شده ازمناطق مختلف چین به این نتیجه رسیدند که مقدار آن تابع موقعیت جغرافیایی و حتی شرایط خاک می باشد.

همچنین مقدار میانگین OA وUA بین اکوتیپ های مورد مطالعه مطابق با نتایج آماری بدست آمده (جدول 2و1) تفاوت معنی داری ندارد. این بدان معناست که اسید تری ترپنیک های مذکور تحت تاثیر اقلیم و شرایط آب و هوایی نبوده است. Gao و همکارانش(2017) نیز در مطالعه بررسی تاثیر موقعیت جغرافیایی و تغییرات آب و هوا بر روی مقادیر اسید بتونیلیک ،بتولین، لوپئول در پوست درخت توس آسیاییBetula platyphylla Suk. در 48 مکان در شمال شرق چین به این نتیجه رسیدند که مقدار اسیدهای تری ترپنیک تحت تاثیر تغییر آب و هوا قرار نگرفته اما مقدار بتولین و لوپئول با افزایش دما و بارندگی افزایش یافته است. به نظر می رسد، مقادیر بعضی از اسید تری ترپنیک ها در گونه های مورد مطالعه می تواند تحت تاثیر اقلیم و موقعیت جغرافیایی نباشند.

 

تقسیم بندی 4 خوشه ای مطابق با HCA بر اساس مقدار BA، OA و UA  برای 29 اکوتیپ عناب مورد مطالعه که در جدول 3 مشخص شده است، نشان می دهد تقسیم بندی بر اساس موقعیت جغرافیایی تا حدودی موفقیت آمیز بوده است به گونه ای که بیشترین اعضا در  خوشه 1 با بیشترین مقدار در این سه اسیدتری ترپنیک تقریبا متعلق به مناطق نزدیک به هم و دریک امتداد از لحاظ جغرافیایی(شرق – شما ل شرق) می باشند،  همچنین در مورد خوشه 4 که کمترین مقدار این سه اسید تری ترپنیک را داراست، کلیه اعضای آن متعلق به مرکز ایران می باشد. از طرفی این دو خوشه متعلق به مناطق جغرافیایی با شرایط آب و هوایی کمی متفاوت نیز هستند(جدول 4). در مطالعه بر روی عناب چینی توسط Song و همکاران (2020) از رویشگاههای مختلف نیز، 15 نوع اسید تری ترپنیک شناسایی و اندازه گیری شده که بر اساس مقدار این اسید تری ترپنیک ها مطابق با HCA  به 5 خوشه تقسیم بندی گردیده و نشان داده شده است که خوشه 3 بیشترین وخوشه 4 کمترین مقدار اسید تری ترپنیک ها را دارا بوده که اعضای آنها موقعیت جغرافیایی مشابهی داشتند.

 در ادامه با بررسی تحلیل واریانس یک طرفه بین خوشه ها مطابق جدول 5 مشخص شد، عملا بین میانگین مقادیر بدست آمده از این سه اسید در خوشه ها تفاوت معنی داری وجود ندارد. به نظر می رسد شرایط آب هوایی معتدل و مرطوب یا گرم و خشک  مناطق مورد مطالعه در تمامی خوشه ها، تفاوت در میزان اسید تری ترپنیک ها ایجاد نکرده است و از طرفی درشت مغذی ها و نوع خاک در اقلیم های ایران شرایط تقریبا یکسانی در تولید محتوای اسید های تری ترپنیک دارند. همچنین شرایط کشاورزی ،کشت و نگه داری از درختان عناب در کلیه مناطق تقریبا به طور سنتی و یکسان بوده است. Song و همکاران (2020) در ادامه تحقیق خود بر روی عناب چینی با روش   PCA ⁷  خوشه بندی بدست آمده از HCA مورد بررسی بیشتری قرار داده و مشخص نمودند  که  به غیر از خوشه 3و 4 سایر خوشه ها به دلیل اینکه در شرایط جغرافیایی یکسان و موقعیت مکانی نزدیک به هم و شرایط کشت مشابه جمع آوری شده بودند ، قابل تفکیک از هم نیستند و در نهایت این طبقه بندی نشان داده که موقعیت جغرافیایی، خاک، اصلاح کشت و بذر در تغییر مقادیر اسید تری ترپنیک ها موثر است. همچنین Viskelis و همکارانش هم (2018) محتوایBA، OA و UA را در پوست سیب مورد مطالعه قرار داده و مشخص کردند که تنظیم رشد سیب در میزان این اسید ها بسیار تاثیر گذار است، از طرفی برش تنه باعث کاهش 16 درصدی کل تری ترپن ها در مقایسه با شاهد و 26 درصد نسبت به هرس تابستانی گردید. همچنین روند تجمع بیشتر تری ترپن ها در میوه ها همراه با کاهش فاصله کاشت درخت سیب مشاهده شد. آب و هوای سردتر و دوره پوشش گیاهی کوتاهتر باعث افزایش مقادیر قابل توجهی از تری ترپن ها در میوه های منطقه آکاسیس در لیتوانی و استونی در مقایسه با میوه های کشت شده در لهستان شد. 

 

نتیجه‌گیری نهایی

تحلیل واریانس آشیانه ای و آزمون توکی نشان داد که تغییرات آب و هوا و موقعیت جغرافیایی تا حدودی در تغییر مقدار BA در 29 اکوتیپ عناب تاثیرداشته است و مطابق با نتایج خوشه بندی مقدارBA  به طور نسبی در مناطق سردتر(شمال شرق و شرق) و حاوی رطوبت بهتر در خاک افزایش داشته است. به نظر می رسد آب و هوای گرم و خشک یا گرم و مرطوب نمی تواند تاثیر بسزایی در تغییر مقدار اسید تری ترپنیک ها داشته باشد. همچنین  مقدار OA و UA تابع تغییرات اقلیمی نبوده که کیفیت خاک و مواد مغذی، یکسان بودن گونه عناب کاشت شده و عدم اصلاح بذر می تواند درتغییر یا عدم تغییر محتوای انواع اسید تری ترپنیک ها در گیاه تاثیر گذار باشد.

این نتایج می‌تواند اهداف مطالعه و برنامه ریزی در  اصلاح نژاد و شناخت بیشتر ویژگی‌های فیتوشیمیایی گیاه در تولید گیاهان دارویی باکیفیت ازنظر خواص دارویی مؤثرتر، تامین نماید. بر همین اساس توزیع جغرافیایی این گیاه دارویی به‌عنوان منبع متنوع ترپنویید ها اهمیت زیادی دارد. همچنین این نتایج می تواند داده‌های ارزشمندی را برای کشت ، اصلاح و در نهایت ارزیابی کیفیت فراورده های دارویی حاصل از عصاره عناب در جهت توسعه آن ارائه ‌دهد. 

    

قدردانی
نویسندگان از دکتر نبوی و دکتر طاهری برای حمایت از کارهای تحقیقاتی در شرکت دانش آزمای نوین باختر و شرکت داروسازی ایده دارو طب (تهران، ایران) نهایت تشکر را دارند.

Reference

1.       Jahan, M., Qadeer, A., Riaz, A., Noor, H. (2022). An overview of the causative factors required to get the best quality jujube. International Journal of Unani and Integrative Medicine. 6(3): 05-07.

 

2.       Bhopi Sweety, C., Jadhav Ravindra, S., Vikhe Dattaprasad, N. (2022). A review on zizyphus jujuba: a tiny plum having eminent potential of copious health benefits. Research Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry14:(2) 107-112.

 

 

3.       Ruan, J., Li, H., Lu, M., Hao, M.,Sun, F.,Yu ,H., Zhang ,Y.,Wang, T. (2023). Bioactive triterpenes of jujube in the prevention of colorectal cancer and their molecular mechanism research. Phytomedicine.110:154639.

 

4.       Song, L., Zhang, L., Xu, L., Ma,Y., Lian, W., Liu, Y., Wang, Y. (2020). Optimized extraction of total triterpenoids from jujube Ziziphus jujuba Mill. and comprehensive analysis of triterpenic acids in different cultivars. Plants. 9(4):412. 

 

 

5.       López-Hortas, L., Pérez-Larrán, P., González-Muñoz, M., Falqué, E., Domínguez, H. (2018). Recent developments on the extraction and application of ursolic acid, A review. Food Research International. 103:130–149. 

 

6.       Fu, Q., Zhang, L., Cheng, N., Jia, M., Zhang, Y. (2014). Extraction optimization of oleanolic and ursolic acids from pomegranate Punica granatum L. flowers. Food Bioprod Process. 92:321–32.

 

 

7.        Wei, M.,  Yang, Y. Extraction characteristics and kinetic studies of oleanolic and ursolic acids from Hedyotis diffusa under ultrasound-assisted extraction conditions. (2014). Separation and Purification Technology. 130:182-192.

 

8.       Wua, H., Li, G., Liu, S., Liu, D., Chen, G., Hu, N., Suo, Y., You, J. (2015). Simultaneous determination of six triterpenic acids in some Chinese medicinal herbs using ultrasound-assisted dispersive liquid–liquid microextraction and high-performance liquid chromatography with fluorescence detection. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 107:98–107.

 

 

9.       Peng,Y., Liu, M. (2010). Analysis of triterpenoid acids in Chinese jujube. Acta Hortic. 853:163-170.

 

10.        Guo S., Zhang, D.,Wei, H., Zhao,Y., Cao,Y.,Yu,T.,Wang,Y.,Yan, X.(2017). Climatic factors shape the spatial distribution of concentrations of triterpenoids in barks of White Birch Betula Platyphylla Suk. Trees in Northeast China. Forests.8(9):334.

 

 

11.       Vilkickyte, G., Raudone,L. (2021). Phenological and geographical effects on phenolic and triterpenoid content in Vaccinium vitis-idaea L. leaves. Plants. 10:1986.

 

12.       Viskelis, J., Uselis, N., Liaudanskas, M., Janulis, V., Bielicki,P., Univer,T., Lepsis, J., Kvikly,D.(2018). Triterpenic acid content in the fruit peel of malus × domestica Borkh. depends on the growing technology. Zemdirbyste-Agriculture.105(1): 71-78.

 

 

1

 

---

[1]  Triterpenic acids

[2]  Saponins

[3]  Jujuboside

[4]  ultrasound-assisted extraction

[5] Analysis of variance

[6]  Hierarchical Clustering

[7] Principal component analysis

---