بررسی اثرات عصاره متانولی زعفران بر انسفالومیلیت خود ایمن تجربی در موشهای C57BL/6
محورهای موضوعی : زیست شناسی سلولی تکوینی گیاهی و جانوری ، تکوین و تمایز ، زیست شناسی میکروارگانیسمشمیلا اسلامبولچی 1 , محمد حسین صنعتی 2 , کمال الدین حق بین 3
1 - گروه زیست شناسی، دانشکده زیست شناسی، دانشگاه آزاد اسلامی- واحد تهران شمال، تهران، جمهوری اسلامی ایران
2 - آزمایشگاه ژنتیک پزشکی، گروه ژنتیک پزشکی، پژوهشگاه مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران
3 - آزمایشگاه بیوشیمی، گروه زیست فرآورده های گیاهی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران
کلید واژه: انسفالومیلیت خود ایمن تجربی, زعفران , میلین اولیگودندروسیت گلیکوپروتئین, ,
چکیده مقاله :
انسفالومیلیت خود ایمن تجربی (EAE) یک بیماری التهابی میلین زدای دستگاه عصبی مرکزی است و معمولا به عنوان یک مدل جانوری برای بیماری مالتیپل اسکلروزیس (MS) استفاده می شود. التهاب یک پدیده مهم در EAE و MS است که به از بین رفتن میلین و در پی آن وقوع ناتوانی حسی و حرکتی منجر می شود. چنین نشان داده شده است که عصاره های کلاله گیاه زعفران (.Crocus sativus L) در موشهای رت فعالیت ضد التهابی دارند. از سویی شواهد داروشناختی جدیدی درباره اثرات ضد توموری، محافظت ژنی، محافظت در برابر عوامل شیمیایی و همچنین توانایی رادیکال خواری برای عصاره های زعفران یا اجزای آن ارائه شده است. ما در این پژوهش مشاهده کردیم که استفاده از دگزامتازون یا عصاره های متانولی کلاله زعفران در دوزهای mg/kg ۱۰۰ یا بیشتر در موشهای ماده C57BL/6 تلقیح شده با pMOG به طور معنی داری از پیشرفت EAE جلوگیری نمودند. عصاره خیسانده آبی زعفران مانع پیشرفت EAE نگردید. نتایج حاصل از این پژوهش حاکی از آن است که زعفران ممکن است با برخورداری از فعالیت ضد التهابی نشانه های EAE را از بین ببرد.
Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory demyelinating disease of central nervous system and commonly used as an animal model for multiple sclerosis (MS). Multiple sclerosis is a disabling neurodegenerative disease in human being. Inflammation is a key event in both EAE and MS, which leads to demyelination and subsequent disability. It is shown that Crocus sativus L. stigma (saffron) extracts have anti-inflammatory activity in rats and mice. There are modern pharmacological evidences for anti-tumour, chemopreventive and genoprotective effects as well as radical scavenger properties of saffron extracts or its constituents. We observed that both therapeutic doses of dexamethasone and methanol extracts of saffron stigma at 100 mg/kg and more prevented EAE from progression significantly in pMOG-immunized female C57BL/6 mice. Aqueous maceration extract of Crocus sativus L. did not prevent EAE progression. These results suggest that saffron may attenuate symptoms of EAE by its anti-inflammatory activity. Experimental data analyzed by one-way ANOVA.
1. 1. Soeda S., Ochiai T., Paopong L., Tanaka H., Shoyama Y., Shimeno H., Crocin suppresses tumour necrosis factor-alpha-induced cell death of neuronally differentiated PC-12 cells. Life Sci. 2001 (69):2887-298
2. Deuvaux B., Enderlin F., Wallner B., Smilek DE., Induction of EAE with recombinent human MOG, and treatment of EAE with a MOG peptide. J Neuroimmunology 1997; (75):169-175
3. Ghazavi A., Mosayebi G., Salehi H., Abtahi H., Effects of ethanol extract of saffron (Crocus sativus L.) on inhibition of experimental autoimmune encephalomyelitis in C57Bl/6 mice. Pak J Biol. Sci. 2009 May; 12(9):690-695 doi:10.3023/pjbs.2009.690.695
4. Gommerman J.L., Giza K., Perper S., Sizing I., Ngam-ek A., Nickerson-Nutter C., Browning J.L., A role for surface lymphotoxin in experimental autoimmune encephalomyelitis independent of LIGHT. J clin Invest. 2003; (112):755-767
5. Probert L., Eugster H.P., Akassoglou K., Bauer J., Frei K., Lassmann H., Fontana A., TNFR1 signalling is critical for the development of demyelination and the limitation of T-cell responses during immune-mediated CNS disease. Brain 2000 (123):2005-2019
6. Linares D, Mana P, Goodyear M, Chow AM, Clavarino C, Huntington ND, Barnett L, Koentgen F., Tomioka R., Bernard C.C.A., Freier-Garabal M., Reid H.H., The magnitude and encephalitogenic potential of autoimmune response to MOG is enhanced in MOG deficient mice. J Outoimmun. 2003; (21):339-351
7. Voskuhl R.R., Mackenzie-Graham A., Chronic Experimental autoimmune encephalomyelitis is an excellent model to study neuroaxonal degeneration in multiple sclerosis. Frontiers in Molecular Neuroscience 2022 October; 01-12 doi; 103389/fnmol.2022.1024058
8. Faridi S., Delirezh N., Abtahi Froushani SM., beneficial effects of hydroalcoholic extract of saffron in alleviating experimental autoimmune diabetes in C57BL/6 mice. Iran J Allergy Asthma Immunol. 2019 February; 18(1):38-47
9. leadbetter E.A., Bourque C.R., Devaux B., Olson C.D., Sunshine G.H., Hirani S., Wallner B.P., Smilek D.E., Happ M.P., Experimental autoimmune encephalomyelitis induced with a combination of myelin oligodendrocyte glycoprotein is ameliorated by administration of a single myelin basic protein peptide. J immunol. 1998; (161):405-512
10. Part E., Martin R., The immunopathogenesis of multiple sclerosis. J Rehablit Res Devl 2002; (39):187-199
11. Paul C., Bolton C., Inhibition of blood brain barrier disruption in experimental allergic encephalomyelitis by short-term therapy with dexamethasone or cyclosporin A. Int J Immunopharmac 1995; (17):497-503
12. Gilgun-Sherki Y., Panet H., Holdengerber V., Mosberg-Galili R., Offen D., Axonal damage is reduced following glatiramer acetate treatment in C57/bl mice with chronic–induced experimental autoimmune encephalomyelitis. Neuroscience research 2003; (47) 201-207
13. Hosseinzadeh H., Younesi H.M., Antinociceptive and anti-inflammatory effects of crocus sativus L. Stigma and petal extracts in mice. BMC Pharmacol. 2002; (2):1-8
14. Poursamimi J., Shariati-Sarabi Z., Tavakkol-Afshari J., Mohajeri SA., Mohamadi M., Crocus sativus (saffron): An immunoregulatory factor in the autoimmune and non-autoimmune diseases. Iran J Allergy Asthma Immunol 2020 May; 19(supple-1):28-42
15. Rois J.L., Rico M.C., Ginger R.M., Manz S., An update review of saffron and its active constituents. Pytother Res. 1996 (10):189-193
16. Hosseinzadeh H., Khosravan V., Anticovulsant effects of aqueous and ethanolic extracts of Crocus sativus L. stigmas in mice. Arch Irn Med. 2002; (5):44-47
17. Hosseinzadeh H., Karimi G.H., Niapoor M., Antidepressant effects of crocus sativus stigma extracts and its constituents, crocin and safranal in mice. Acta Hort (ISHS) 2004; (650) 435-45
18. Abdullaev F.I., Cancer chemopreventive and tumoricidal properties of saffron (crocus sativus L.). Exptl Biol Med. 2002b; (227):20-25
19. Abe K, Sugiura M., Shoyama Y., Saito H., Crocin antagonizes ethanol inhibition of NMDA receptor-mediated responses in rat hippocampal neurons. Brain Research 1998; (787):132-138
20. Abe K, Sugiura M., Yamaguchi S., Shoyama Y., Saito H., Saffron extract prevents acetaldehyde-induced inhibition of long-term potentiation in rat dendate gyrus in vivo. Brain Research 1999; (581):287-289
21. Soeda S., Ochiai T., Paopong L., Tanaka H., Shoyama Y., Shimeno H., Crocin suppresses tumour necrosis factor-alpha-induced cell death of neuronally differentiated PC-12 cells. Life Sci. 2001 (69):2887-298
22. Zhang Y.X., Sugiura M., Saito H., Shoyama, Y., Acute effects of Crocus Sativus L.on passive avoidance performance in mice. Biol Pharmachol Bull. 1994 (17):217-221
23. Soeda S., Ochiai T., Paopong L., Tanaka H., Shoyama Y., Shimeno H., Crocin suppresses tumour necrosis factor-alpha-induced cell death of neuronally differentiated PC-12 cells. Life Sci. 2001 (69):2887-298
24. Nair S.C., Kurumboor S.K., Hasegawa J.H., Saffron chemopeventive in biology and medicine: a review. Cancer Biother. 1995; (10):257-264
25. Premkumar K., Abraham S.K., Santhiya S.T., Gopinath P.M., Ramesh A., Inhibition of genotixicity by saffron (Crocus sativus L.) in mice. Drug Chem Toxicol. 2001; (24):421-428
26. Premkumar K., Abraham S.K., Santhiya S.T., Ramesh A., protective effects of saffron (crocus sativus L.) on genotoxins-induced oxidative stress in swiss albino mice. Phytother Res. 2003; (17):614 –17
27. Hosseinzadeh H., Sadeghnia H.R., Safranal, a constituent of Crocus sativus (saffron) attenuated cerebral ischemia induced oxidative damege in rat hippocampus. J Pharm Pharmaceut Sci. 2005; (8):394-399
28. Gharagozloo M., Mace J.W., Calobresi P. A., Animal models to investigate the effects of inflammation on remyelination in multiple sclerosis. Frontiers in Molecular Neuroscience 2022 November; 01-10 doi:10.3389/fnmol.2022.995477
29. Ghazavi A., Mosayebi G., Salehi H., Abtahi H., Effects of ethanol extract of saffron (Crocus sativus L.) on inhibition of experimental autoimmune encephalomyelitis in C57Bl/6 mice. Pak J Biol. Sci. 2009 May; 12(9):690-695 doi:10.3023/pjbs.2009.690.695
30. Escribano J., Diaz-Guerra M.J.M., Reise H.H., Ontanon J., Garcia-Olmo D., Garcia-Olmo D.C., Robio A., Fernandez J.A., IN vitro activation of macrophages by a novel proteoglycan isolated from corms of crocus sativus L. Cancer Letters 1999; (144):107-114
31. Azari H., Ebrahimi S., Saeb s., Ghanbari A., et al., The effect of saffron aquatic extract and crocin on the differentiation of Neuralstem cells into oligodendrocyte precursor cells. Shiraz E-Medical Journal 2018 March;19(3): e60190
32. Moshiri M., Vahabzadeh M., Hosseinzadeh H., Clinical application of saffron (Crocus sativus) and its constituents: A Review. Drug Res. (stuttg) 2015 Jun; 65(6):287-295
بررسی اثرات عصاره متانولی زعفران بر انسفالومیلیت خود ایمن تجربی در موشهای C57BL/6
چکیده
انسفالومیلیت خود ایمن تجربی (EAE) یک بیماری التهابی میلینزُدای دستگاه عصبی مرکزی است و معمولا به عنوان یک مدل جانوری برای بیماری مالتیپل اسکلروزیس (MS) استفاده میشود. التهاب یک پدیده مهم در EAE و MS است که به از بین رفتن میلین و در پی آن وقوع ناتوانی حسی و حرکتی منجر میشود. چنین نشان داده شده است که عصارههای کلاله گیاه زعفران (Crocus sativus L.) در موشهای رت فعالیت ضد التهابی دارند. از سویی شواهد داروشناختی جدیدی درباره اثرات ضد توموری، محافظت ژنی، محافظت در برابر عوامل شیمیایی و همچنین توانایی رادیکال خواری برای عصارههای زعفران یا اجزای آن ارائه شده است. ما در این پژوهش مشاهده کردیم که استفاده از دگزامتازون یا عصاره های متانولی کلاله زعفران در دوزهای mg/kg ۱۰۰ یا بیشتر در موشهای ماده C57BL/6 تلقیح شده با pMOG به طور معنی داری از پیشرفت EAE جلوگیری نمودند. عصاره خیسانده آبی زعفران مانع پیشرفت EAE نگردید. نتایج حاصل از این پزوهش حاکی از آن است که زعفران ممکن است با برخورداری از فعالیت ضد التهابی نشانههای EAE را از بین ببرد.
کلید واژگان: انسفالومیلیت خود ایمن تجربی، زعفران، میلین اولیگودندروسیت گلیکوپروتئین
مقدمه
انسفالومیلیت خود ایمن تجربی (EAE) یک بیماری التهابی دستگاه عصبی مرکزی است که به واسطه فعالیت سلولهای T به وجود میآید و در جوندگان و سایر گونههای جانوری با تزریق میلین، پروتئینهای میلین و پپتیدهای خاصی از پروتئینهای میلین به عنوان آنتیژن هایی که میتوانند واکنش ایمنی ایجاد کنند، القاء میشود (٢۹، ۶، ١۹). از میان این آنتیژنهای بالقوه، گلیکوپروتئین اولیگودندروسیتی میلین (MOG) برای القای EAE در موشهای C57BL/6 بهترین انتخاب است (١٢، ٢۷، ١۸). التهابی که توسط القای EAE در دستگاه عصبی مرکزی رخ میدهد به فلج و دیگر ناهنجاریهای عصبی منجر میشود که از بسیاری جهات مشابه بیماری اسکلروز چندگانه (مالتیپل اسکلروزیس) در انسان است. مالتیپل اسکلروزیس (MS) یک بیماری خود ایمن ناتوان کننده عصبی است که چنین تصور میشد که اغلب ماده سفید را در دستگاه عصبی مرکزی (CNS) مورد هدف قرار میدهد اما امروزه با استفاده از روش تصویر برداری رزونانسی مغناطیسی (MRI) مشخص شده است که با پیشرفت بیماری MS آتروفی پارانشیم مغزی و ماده خاکستری (GM) هم به ویژه در هر دو نوع عود کننده- بهبود یابنده و پیشرونده ثانویه اتفاق میافتد (۳۰). آتروفی پیشرونده GM به شدت با بروز ناتوانی بالینی در بیماری MS در ارتباط است و شاخص مهمی در پیشرفت بیماری است. بروز التهاب، از بین رفتن میلین و تخریب نورونی سه شاخص بیماری مالتیپل اسکلروزیس هستند که به طور کامل به هم پیوسته هستند. بهترین مدل جانوری برای درک چگونگی پیشرفت این وقایع مدل تجربی EAE مزمن ایجاد شده با استفاده از پپتید MOG35-55 در موشهای C57Bl/6 است (۳۰) که اصولا مستعد ابتلا به بیماریهای خود ایمن هستند (۸). علت بروز بیماری MS هنوز به طور کامل روشن نشده است اما، معلوم شده است که وقوع التهاب و پاسخهای ایمونولوژیک در آغاز و پیشرفت بیماری نقش دارند (١۷، ٢٢، ٢۳، ٢۷) اما مشخص نشده است که التهاب چگ.نه باعث تخریب بافت عصبی میشود (۳۰). در آزمایشاتی، پاسخ التهابی که منجر به ازبین رفتن میلین و مرگ اولیگودندروسیتی میشود با دخالت بازخوردهای مثبت و منفی بر علیه آنتیژنهای خودی بدن فعال شدند و سبب بروز علایم بالینی بیماری شدند (١١، ٢٢). شواهد آزمایشگاهی اخیر نشان دادهاند که کلاله گیاه زعفران با نام علمی Crocus sativus L. فعالیت حاد و مزمن ضد التهابی دارد (١۴).
زعفران از مولکولهای شناخته شدهای همچون آب، روغنهای فرّار، مواد نیتروژن دار، فیبر، قندها تشکیل شده است. زعفران همچنین محتوی دو ویتامین مهم شامل ریبوفلاوین و تیامین، انواعی از استرولهای گیاهی و انواعی از اسیدهای چرب است. مهمترین جزء فرار زعفران سافرانال است که مسئول اصلی عطر زعفران است. کروسین جزء دیگری است که مسئول ایجاد رنگ زعفران است و متابولیت آن کروستین ویژگیهای آنتی اکسیدانی قوی دارد (٢۴).
زعفران در طب سنتی به عنوان یک داروی ضد اسپاسم، بهبود دهنده هضم و ضد نفخ، ضد نزله، خلط آور، انگیزاننده، تعریق زا، مقوی قوای جنسی، قاعدگی آور، تسکین دهنده لثه و تسکین دهنده اعصاب به کار میرود (٢۸). مطالعات داروشناختی اخیر نشان دادهاند که عصاره زعفران یا اجزای فعال آن اثرات ضد تشنج و ضد افسردگی (١۳، ١٥، ٢۴)، ضد توموری (۲، ١١)، بهبود دهنده یادگیری و حافظه و ویژگیهای رادیکال خواری (۳، ۴، ۲۸، ۳۲) دارد. عصاره زعفران باعث القای استرس اکسیداتیو در موش میشود (۱، ۲١، ۲٥، ۲۶). به علاوه، اجزای زعفران در شرایط آزمایشگاهی با مهار سایتوکین پیش التهابیِ TNF-alpha مانع مرگ برنامه ریزی شده سلول میشود (۲۹) و از رتها در برابر آسیب اکسیداتیو القا شده توسط ایسکمی محافظت میکند (١۶، ٢۴).
میلین زدایی در بیماریهای نورودژنراتیو و از جمله در بیماری مالتیپل اسکلروزیس با از دست رفتن حمایت تروفیک، آکسونهای مستعد تخریب عصبی (نورودژنراسیون) را در گیر میکند و بازسازی میلین یک فرایند محافظ عصبی است که احتمال دارد عملکردهای از دست رفته را بازگرداند. در حالی که ترکیبات بالقوه میلین ساز متعددی در پژوهشهای آزمایشگاهی شناسایی شدهاند اما همه آنها موفقیت محدودی در آزمایشهای بالینی انجام شده بر روی بیماران مبتلا به MS نشان دادهاند. در بیماری MS التهاب مزمن و آسیب آکسونی با میلین سازی تداخل میکنند. هم نقص داخلی دودمان سلولی اولیگودندروسیتی و هم ممانعتهای حاصل از روند ریز آسیبهای محیطی که به بخشهای مختلف عصبی وارد میشود تمایز سلولهای پیشساز اولیگودندروسیتی–که برای بازسازی میلین و درمان ضروری است- و تولید غلافهای میلین جدید را به شیوهای منفی تحت تاثیر قرار میدهند (۹). لاجرم در درجه نخست استفاده از مدلهای جانوری برای درک چگونگی پیشرفت روند بیماری و سازوکارهای پیچیده آن و همچنین برای پیشرفت موفقیت آمیز درمانهایی که منجر به میلین سازی در MS میشوند ضروری است. در این راستا مدل جانوری EAE به وفور برای پژوهش در زمینه یافتن درمانهای بالقوه برای بیماری MS مورد استفاده قرار گرفته است. ضرورت دیگر یافتن مواد و داروهایی است که علاوه بر اثر بخشی در شرایط آزمایشگاهی و پیش بالینی، در شرایط بالینی بر روی نمونه انسانی هم اثر بخش باشد. هدف از انجام مطالعه حاضر ارزیابی اثرات ضد التهابی عصارههای آبی و الکلی کلاله زعفران (crocus sativus L.) در موشهای مبتلا شده به EAE به عنوان مدلی جانوری برای اسکلروز چندگانه (MS) بوده است.
مواد و روشها
جانوران
در این پژوهش از موشهای C57BL/6 ماده ۶ تا ۸ هفتهای با وزن بین ۱۴-۱۸ گرم استفاده شد که از بخش حیوانخانه انیستیتو پاستور کرج خریداری شده بودند. حیوانات در اتاقی اختصاصی و به دور از سایر جانوران در شرایط استاندارد آزمایشگاهی: دمای ثابت (C ° ۲ ± ۲۲)، رطوبت (۳۰%)، چرخه روشنایی و تاریکی ۱۲:۱۲ ساعته و دسترسی آزاد به آب و غذا در حیوانخانه پزوهشگاه ملی مهندسی زنتیک و بیوتکنولوزی (NIGEB) نگهداری شدند.
مواد شیمیایی
گلیکوپروتئین اولیگودندروسیتی میلین (MOG) رتی شامل اسید آمینههای ٥٥-۳٥ (MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK) ، ادجاونت کامل فرویند (CFA) و سم سیاه سرفه (لیوفلیزه) از سیگما خریداری شدند. متانول ( اکسترا پیور)، اِن- هگزان سدیم کلراید، پتاسیم کلراید، Na2HPO4 و KH2PO4 از مِرک (Merck) خریداری شدند.
القای انسفالومیلیت خود ایمن تجربی (EAE) با استفاده از پپتید MOG
برای القای انسفالومیلیت خود ایمن تجربی، سیستم ایمنی جانوران به روش زیر تحریک شد:
۳۰۰ میکرولیتر از امولسیون ۱:۱ محتوی ۲٥۰ میکروگرم از pMOG35-55 حل شده در سالین بافری فسفات (PBS) و ادجاونت کامل فرویند (CFA) که با ۴ میلی گرم/ میلیلیتر مایکوباکتریوم توبرکلوزیس H37Ra غیر فعال شده با حرارت کامل شده بود به یکی از پهلوهای جانور به شیوه زیر جلدی تزریق شد. یک دز معادل یک هفته بعد در پهلوی مقابل تزریق شد. در همان روز ایمنی زایی و ۴۸ ساعت بعد از آن به هر موش ۴۰۰ نانو گرم سم سیاه سرفه به شیوه داخل صفاقی تزریق شد (۲۴).
ارزیابی نورولوژیک EAE
موشها روزانه از نظر علایم EAE مورد مشاهده قرار گزفتند و از ۶-۰ با، فواصل ٥/۰ تایی برای درجه بندی آسیبهای بینابینی، نمره گذاری (رتبه بندی) شدند. علایم نورولوژیک به قرار زیر رتبه بندی شدند:
۰= هیچ علامت بالینی ندارد، ١= قوام (تونیسته) دم از دست رفته است، ۲= فلج نسبی اندام عقبی، ۳= فلج کامل اندام عقبی،
۴= فلج اندام جلویی، ٥= فلج چهار اندام (پاراپلژی)، ۶= روبه مرگ یا مرده.
مشاهده برای ۶۰ روز پیاپی انجام شد و وزن موشها به طور تصادفی اندازه گیری شد. غذا در دسترس موشهای بیتحرک قرار گرفت. به حیواناتی که به دلیل فلجی نمیتوانستند غذای عادی موشها را بخورند روزی 2 بار محلول ساکارز و آب به روش گاواژ از راه دهان خورانده میشد.
چندین پارامتر برای ارزیابی پیشرفت EAE و اثر تجویز عصاره زعفران مورد بررسی قرار گرفتند:
میانگین نمره بالینی یا MCS (mean clinical score) به عنوان جمع نمرههای بالینی برای همه موشهای یک گروه در طی چندین روز معین تقسیم بر تعداد موشهای آن گروه محاسبه شد. موشی که نمره ۶ گرفته بود در روز بعد از مرگ، در محاسبه نمره بالینی متوسط (MCS) به حساب نیامد.
با تعیین بیشینه نمره بالینی برای همه موشهای یک گروه در طی دوره آزمایش و تقسیم آن بر تعداد کل موشهای آن گروه متوسط میانگین بیشینه شدت یا MMS (mean maximum severity) محاسبه شد.
اندکس بیماری یا DI (disease index) با اضافه کردن متوسط نمرههای بیماری برای هر موش در یک گروه در طی یک بازه زمانی معین تقسیم بر تعداد کل موشهای آن گروه به دست آمد.
تیمار
حیوانات به ١۴ گروه تقسیم شدند. و هر گروه شامل ١۰ بود. یک کروه به عنوان کنترل (گروه sham) در نظر گرفته شد. به این معنی که ایمنی زایی در اعضای آن ایجاد شد ولی هیچ عصاره زعفرانی دریافت نکردند. گروههای ٥-١ عصاره متانولی کلاله زعفران یا MCSE (methanol extract of crocus sativus stigma) را در دُزهای (۲٥، ٥۰، ١۰۰، ٥۰۰ و ١۰۰۰ میلیگرم به ازای هر کیلوگرم از وزن بدن) به صورت داخل صفاقی دریافت نمودند (١۰). گروههای ١۰-۶ عصاره آبی زعفران یا ACSE (aqueos extract of crocus sativus) را در دُزهای (٥۰، ١۰۰، ۲۰۰، ۴۰۰ و ۸۰۰ میلیگرم به ازای هر کیلوگرم از وزن بدن) به شیوه داخل صفاقی دریافت نمودند (١۰). تجویز عصارهها زمانی آغاز شدند که نمره بیماری دست کم ۳ بود. تیمار برای ١٥روز پیاپی ادامه یافت. به اعضای یک گروه به ازای هر موش ١۰۰ میکرولیتر محلول PBS داخل صفاقی تجویز شد (کنترل منفی). به دو گروه باقیمانده دگزامتازون داخل صفاقی با دزهای (٥/۰ و ١ میلیگرم به ازای هر کیلوگرم از وزن بدن) تزریق شد (١۰). این دو گروه آخر به عنوان کنترل مثبت در نظر گرفته شدند.
روش استخراج عصارهها
برای عصاره گیری از کلالههای خشک زعفران (Crocus salivus L.) قرمز خالص ایرانی کشت داده شده در مزرعه محلی پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، اهدایی دکتر کمالالدین حق بین، استفاده شد.
تهیه عصاره متانولی زعفران به شیوه زیر انجام شد:
٥ گرم از کلاله خشک زعفران در دمای اتاق و در تاریکی سه نوبت در اِن-هگزان برروی دستگاه همزن، همزده شد تا چربی زدایی شود. سپس سه مرتبه با متانول اکسترا پیور (٧۰%) شستشو داده شد. عصارههای متانولی حاصل به هم اضافه شدند و با استفاده از صافی ۴٥/۰ میکرومتری (Schleicher & Schuell disposable filter holders) صاف شدند. مایع بالایی با استفاده از اسپکتروفوتومتر نورمرئی/ فرا بنفش (UV/Visible spectrophotometer) در بازه طیفی ۲۰۰ تا ٧۰۰ نانومتر مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت (مدل دستگاه مورد استفاده:Cecil spectrophotometer, CE 9500, 9000 series بود). بلافاصله پس از طیف سنجی، به منطور حذف متانول، با استفاده از روش تبخیر چرخشی عصاره تحت شرایط خلاء، در تاریکی و در دمای ۳٥ درجه سانتیگراد تغلیظ شد. (مدل دستگاه مورد استفاده: BUCHI Rotavapor R-200/205, BUCHI vacuum system V-500 and BUCHI vacuum controller V-800/805 بوده است). رسوب خیس حاصل در آب مقطر دیونیزه حل و سپس لیوفلیزه شد.
جهت تهیه عصاره آبی زعفران به شیوه زیر عمل شد:
٥ گرم از کلاله خشک زعفران در هاون چینی ساییده شد و دوبار، هربار به مدت ۳ ساعت در ٢٥ میلیلیتر اِن- هگزان خیسانده شد. مایع رویی دور ریخته شد و باقیمانده در دمای اتاق و در تاریکی به مدت یک ساعت در آب مقطر با استفاده از همزن برقی هم زده شد. پس از استخراج عصاره، نمونهها به مدت ١۰ دقیقه با سرعت ۳۰۰۰۰ دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند و سپس از صافی واتمن (Whatman filter GF/F 0.7 μm) عبور داده شدند تا بقایای گیاهی از عصاره جدا شود. مایع حاصل با استفاده از دستگاه Cecil در بازه طیفی nm ۷۰۰-٢۰۰ مورد طیف سنجی(اسپکتروفوتومتری) قرار گرفت. بلافاصله بعد از طیف سنجی عصارههای محلول در آب با هم یکی شدند و تحت شرایط خلاء تغلیظ و در شرایط انجماد خشک شدند.
در هردو روش عصاره گیری، پودرهای لیوفلیزه به اندازههای کوچک تقسیم شده و در میکروتیوبهای جداگانه تا زمان مصرف در دمای C° ٢۰- نگهداری شدند. بازده وزنی (w/w) عصارههای آبی و متانولی کلالههای زعفران به ترتیب ۳/٥۳% و ۷/٥۹% بود.
تهیه محلولهای تزریقی
برای تهیه محلولهای تزریقی پودرهای خشک در دمای اتاق قرار داده شدند. با ترازوی حساس وزن کشی شدند و در بافر نمکی فسفات (PBS) به عنوان بستر حامل حل شدند و به طور جداگانه بر اساس غلظت خود در ظروف در بسته اتوکلاو شده تا زمان تزریق نگهداری شدند. محلولهای تزریقی به صورت تازه و روزانه تهیه میشدند. حداکثر حجم تزریقی در هربار ml ١/۰ بود.
تجزیه و تحلیل آماری
اختلافهای آماری معنی دار در مورد MCS، DI و MMS با روش ANOVA یک طرفه با (p ≤ 0.001) و آزمونهای تعقیبی (post hoc comparisons) با استفاده از Scheffe’s F test با (p ≤ 0.05) تعیین شدند. دادههای حاصل از میانگین نمره بالینی روزانه ± خطای استاندارد (daily MCS ± SE) برای رسم منحنیها به کار رفتند.
نتایج
انسفالومیلیت خود ایمن تجربی (EAE) در موشهای ماده C57BL/6 با استفاده از pMOG35-55 القا شد. حیوانات به طور تصادفی وزن شدند و روزانه از نظر بروز علایم بیماری مشاهده شدند و بر اساس دستور گفته شد در بخش روشها نمره دهی شند.تیمار دارویی هنگامی اغاز شد که هر موش (در هر گروه) در مرحله شدید بیماری قرار داشت یعنی دست کم نمره بیماری او به مدت یک روز ۳ یا بیشتر بود. آنچنان که درنمودار ١ نشان داده شده است mg/kg ١۰۰ و mg/kg ٥۰۰ و mg/kg ١۰۰۰ از عصاره متانولی کلاله زعفران (MCSE) به طور معنی داری MCS را در مقایسه با دزهای کمتر و گروههای تیمار شده با PBS و گروه shamکاهش داده است (P ≤ 0.001) .
نمودارهای ٢ و ۳ نشان میدهند که اندکس بیماری (DI) و میانگین بیشینه شدت (MMS) در EAE با همان دزهای کاهش دهنده MCS از عصاره متانولی زعفران کاهش مییابند اما دزهای mg/kg ١۰۰ و mg/kg ٥۰۰ در کاهش DI از دز mg/kg ١۰۰۰ موثرترند.
به عنوان کنترل مثبت برای عصاره زعفران از دگزامتازون استفاده شد. نمودار ۴ نشان میدهد که اثرات mg/kg ٥/۰ و mg/kg ١ از دگزامتازون (Dex) بر MCS مشابه اثرات کاهش دهنده MCSE در دزهای mg/kg ١۰۰۰-١۰۰ است.
همچنان که درنمودارهای ٥ و ٦ و ۷ نشان داده شده است تجویز عصاره آبی زعفران (ACSE) در موشهای مبتلا به EAE در دزهای غیر کشنده (g/kg body weight ۸/۰- ۰٥/۰) هیچ اثر سرکوبگری بر علایم بالینی ندارد.
معنی داری تفاوتها در روز شروع بیماری میان گروهها ارزیابی نشد زیرا بررسی این موضوع در دستور کار این پژوهش نبود. همچنان که نمودار ۸ نشان میدهد شروع و پیشرفت EAE در همه نمونهها مشابه بود. بعد از شروع تیمار، کاهشی تدریجی اما معنی دار در میانگین نمرههای بالینی در نمونههایی که mg/kg ١۰۰ و mg/kg ٥۰۰ از عصاره متانولی کلاله زعفران دریافت نموده بودند مشاهده شد. دز mg/kg ١۰۰۰ از MCSE اثر بخشی کمتری داشت و تغییرات روزانه در MCS در پاسخ به این دز تدریجیتر بود.
نمودار ۹ نشان میدهد که ACSE نمیتواند در میانگین نمرهها بالینی در موشهای مبتلا شده به EAE تغییری ایجاد کند. همچنان که به خوبی در این منحنیها قابل تشخیص است از کمترین دز تا بیشترین دز عصارههای آبی هیچ تغییری در پیشرفت و شدت بیماری EAE ایجاد نمیکنند.
نتایج بالینی گروههای مختلف تیمار شده با عصارههای متانولی و آبی زعفران، دگزامتازون، PBS وMOG به همراه ادجاونت (گروه sham) در جدول ١ ارائه شده است. برای اختلافهای معنی دار با p ≤ 0.001 از علامت سه ستاره استفاده شده است. اشکال ١ و ٢ منحنیهای مربوط به طیف سنجی UV/Visible عصارههای متانولی و آبی زعفران را در گستره نور مرئی/ فرابنفش nm ٧۰۰- ٢۰۰ نمایش میدهند.
نمودار ١: اثر MCSE بر میانگین نمرههای بالینی در موش ماده C57BL/6 مبتلا به EAE القا شده با pMOG در مقایسه با گروه کنترل منفی (PBS) و گروه sham (MOG). آنالیز واریانس یک طرفه و آزمون تعقیبی شفه بین میانگینها ± SEM نشان دهنده اختلاف معنی دار با p ≤ 0.001 است.
نمودار ٢: اثر MCSE بر اندکس بیماری ± SEM نشان دهنده اختلاف معنی دار میان دزهای mg/kg ١۰۰، mg/kg ٥۰۰ و mg/kg ١۰۰۰ با دیگر گروهها است (p ≤ 0.001).
نمودار ۳: اثر MCSE بر MMS در موشهای ماده مبتلا به EAE حاصل از ایمونیزاسیون با pMOG نشان دهنده اختلافهای معنی داری بین گروهها است (MMS ± SEM, P ≤ 0.001).
نمودار ۴: دگزامتازون در دزهای mg/kg ٥/۰ و mg/kg ١ به موشهای C57BL مبتلا به EAE تزریق شد. اثرات آن با اثر دزهای سرکوبگر التهاب عصاره متانولی زعفران و با PBS مقایسه شد. نتایج نشان دهنده اختلاف معنی داری میان موشهای تیمار شده با PBS با سایر گروههای تجربی است (MCS ± SEM, P ≤ 0.001) .
نمودار ٥: میانگین نمرههای بالینی در موشهای ماده C57BL/6 مبتلا شده به EAE در پی دریافت pMOG تحت تاثیر تیمار با دزهای مختلف عصاره آبی زعفران در مقایسه با گروههای کنترل منفی (PBS) و گروه sham (MOG) . عصارههای آبی زعفران هیچ اثر سرکوبگر یا تخفیف دهندهی معنی داری بر MCS نشان نمیدهند (MCS ± SEM, P ≤ 0.001).
نمودار ٦: تجویز ASCE در غلظتهای مختلف هیچ اختلاف معنی داری بر اندکس بیماری در موشهای ماده C57BL/6 مبتلا به EAE القا شده با pMOG در مقایسه با گروههای کنترل منفی (PBS) و sham (MOG) نشان نمیدهد (DI ± SEM, P ≤ 0.001).
نمودار ٧: مقایسه میانگین بیشینه شدت در موشهای ماده C57BL/6 تیمار شده با 5 غلظت مختلف از ACSE با گروه کنترل منفی (PBS) و گروه sham (MOG). هیچیک اختلاف معنی داری را نشان نمیدهند (MMS ± SEM, P ≤ 0.001) .
الف
ب
نمودار ۸: منحنی های الف و ب نمایانگر اثرات سرکوبگر سه دز ١۰۰، ٥۰۰ و ١۰۰۰ میلی گرم از عصاره متانولی زعفران بر MCS روزانه در مقایسه با سایر گروهها هستند.
نمودار ۹: منحنی مربوط به رابطه میان اثر دزهای مختلف عصاره آبی زعفران با MSC روزانه در موشهای ماده C57BL/6 مبتلا شده به EAE و مقایسه آنها با اثرات تزریق PBS و MOG (گروه کنترل یا همان sham). منحنیها هیچ اختلاف معنی داری را با هم نشان نمیدهند.
جدول١- نشان دهنده تغییرات علایم نورولوژیک در موشهای ماده C57BL/6 مبتلا به EAE متعاقب تجویز عصارههای متانولی و آبی کلالههای زعفران در مقایسه با گروههای شاهد مثبت (دگزامتازون)، کنترل منفی (PBS) و sham (MOG + adjuvant)
Treatment (mg/kg body weight) | N | Disease index ± SEM | Mean maximum severity ± SEM
| Mean clinical score ± SEM |
Methanol extract |
|
|
|
|
25 | 10 | 2.06± 0.098 | 4.55± 0.122 | 121.75± 5.59 |
50 | 10 | 2.147± 0.103 | 4.45± 0.145 | 129.05± 6.22 |
100 | 10 | 1.41± 0.042*** | 3± 0.052*** | 84.75± 2.53*** |
500 | 10 | 1.47± 0.046*** | 3.2± 0.116*** | 88.85± 2.73*** |
1000 | 10 | 1.53± 0.02*** | 3± 0.131*** | 92± 4.08*** |
Aqueous extract |
|
|
|
|
50 | 20 | 2.04± 0.03 | 4.475± 0.19 | 122.4± 1.6 |
100 | 20 | 2± 0.046 | 4.075± 0.21 | 121.3± 2.97 |
200 | 20 | 2.06± 0.056 | 4.525± 0.236 | 122.8± 2.5 |
400 | 20 | 2.051± 0.033 | 4.4± 0.226 | 123.4± 2.07 |
800 | 20 | 1.99± 0.11 | 4.425± 0.223 |
|
Dexamethasone |
|
|
|
|
0.5 | 10 | 1.44± .052 *** | 3.3± 0.052*** | 86.45± 3.171 *** |
1 | 10 | 1.318± .03 *** | 3.25± 0.14 *** | 79.25± 1.85 *** |
PBS | 10 | 2.36 ± 0.08 | 4.75± 0.263 | 132.35± 4.77 |
MOG+ adjuvant | 10 | 2.17± 0.133 | 4.7± 0.274 | 130.15± 7.89 |
معنی داری اختلافها از گروه تیمار شده با PBSو از گروه تیمار شده با MOG + adjuvant : *** (P ≤ 0.001)
شکل ١- طیف عصاره آبی کللاله زعفران در بازه ۷۰۰- ٢۰۰ نانومتر
شکل ٢- طیف عصاره متانولی زعفران در بازه ۷۰۰- ٢۰۰ نانومتر: در فاصله بحرانی مخصوص مواد موثره زعفران تفکیک بیشتری را نسبت به عصاره آبی نشان میدهد.
شکل ۳- موش C57lBL6 مبتلا شده به سطح ١ از مدل تجربی انسفالومیلیت خود ایمن تجربی. به شکل حلقهای دم توجه کنید.
بحث
کوششهای بسیاری به کار گرفته شده است تا مواد جدیدی برای مهار یا سرکوب پیشرفت بیماری مالتیپل اسکلروزیس یافت شوند. در دهه اخیر، توجه زیادی به سوی محصولات گیاهی و مواد طبیعی که بتوانند نشانههای بالینی MS را محدود کنند از جمله زعفران، معطوف شده است.
قزوی و همکاران در ٢۰۰۹ نشان دادند که استفاده از عصاره اتانولی زعفران در موشهای C57BL/6 مبتلا شده به مدل تجربی EAE با استفاده از پپتید MOG35-55 ، ظرفیت آنتی اکسیدانی کل را افزایش و ارتشاح (انفیلتراسیون) گلبوبهای سفید را به داخل CNS کاهش میدهد. همچنین موشهایی که به شیوه چیش تیمار عصاره الکلی زعفران را دریافت کرده بودندنسبت به موشهای کنترل دیرتر و خفیفتر به EAE مبتلا شدند (١۰).
در پژوهش حاضر به منظور حرکت در مسیر دستیابی هر چه سریعتر به امکان مهار علایم و یا شاید درمان این بیماری بسیار ناتوان کننده با استفاده از ایجاد مدل تجربی انسفالومیلیت خود ایمن تجربی به عنوان مدلی جانوری برای مالتیپل اسکلروزیس از روش عصاره گیری زعفران به دو شیوه الکلی (متانولی) و آبی بهره گرفتیم. همچنان که در بخش نتایج عنوان شد عصاره متانولی کلاله زعفران نشانه های EAE را در موشها سرکوب کرد اما عصاره آبی زعفران تاثیری نداشت. این در حالی است که یافته های حاصل از پژوهش آذری و همکاران در ٢۰١۸ حاکی از آن است که عصاره آبی زعفران و کروسین سطح مولکول Olig2 را در موشهای مبتلا به EAE به عنوان شاخص تمایز اولیگودندروسیتی افزایش میدهد (٥). بیشینه دُز غیر کشنده عصاره متانولی زعفران ٢ گرم به ازای هر کیلوگرم از وزن بدن رت و موش است ولی با مصرف دزهای بیش g/kg ١ خطر بروز مسمومیت و حتی مرگ به طور فزایندهای افزایش مییابد (١۳، ١۴). ما در این آزمایش از دزهای g/kg ١ و کمتر عصاره متانولی زعفران استفاده کردیم تا از بروز مسمومیت و دیگر عوارض جانبی در موشها پیشگری شود. فعالیت سرکوبگر MCSE شباهت بسیار زیادی به اثرات حاصل از دگزامتازون دارد. دگزامتازون یک داروی ضد التهاب است که در روند درمان حاد اسکلروز چند گانه در انسانهای مبتلا مورد استفاده قرار میگیرد. شواهدی وجود دارد مبنی بر این که دگزامتازون میتواند جلوی تخریب سد خونی مغزی را بگیرد. این دارو EAE را در رتها سرکوب میکند. شباهت اثرات سرکوبگر دگزامتازون و عصاره متانولی زعفران بر علایم EAE حاکی از آن است که شاید عصاره متانولی هم از تخریب سد خونی مغزی جلوگیری، و به عنوان یک ترکیب سرکوب کننده ایمنی عمل میکند اما، این موضوع نیازمند بررسی و تحقیق است.
پژوهشگران همچنین برای عصارههای آبی و اتانولی اجزای کلاله، گلبرگ و پیاز Crocus sativus L. اثر ضد التهابی گزارش نمودهاند (٧، ١۴). انجام مطالعات شیمیایی بر روی کلاله Crocus sativus نشان دهنده وجود ترکیباتی همچون کاروتنوئیدها، آلکالوئیدها و ساپونینها در آن است. اثرات سرکوبگر علایم انسفلومیلیت حاصل از MCSE میتواند مربوط به عملکرد یکی از اجزاء آن باشد. به ویژه در پژوهش منتشر نشدهای که توسط همین گروه پژوهشی انجام شده است نشان داده شده است که کروسین (کاروتنوئید مسئول رنگ قرمز زعفران) استخراج شده از کلاله زعفران، اثر ضد التهابی دارد و اثر مهار کننده علایم بالینیEAE آن مشابه اثرات سرکوبگر MCSE است.
آذری و همکاران در پژوهش خود نشان داده اند که کروسین در مدل EAE در موشهای C57BL/6 مانع میلین زدایی و فعالیتهای تخریب گر عصبی میشود. به علاوه این ماده اثرات ضد التهابی بر روی سلولهای میکروگلی مغزی دارد (٥).
پورصمیمی و همکاران در سال ٢۰٢۰ اعلام نمودهاند که زعفران درمانی در موشهای مبتلا به آسیب مغزی القا شده با ایسکمی هیپوکسیک، التهاب را کاهش و اثر درمان هیپوترمی را افزایش میدهد (٢۴).
معلوم نیست که چرا عصاره آبی زعفران در این پزوهش نشانههای نورولوژیک متداول EAE را سرکوب نکرد ولی عصاره متانولی این اثر را نشان داد. البته چنین حدس زده میشود که متانول بهتر و سریعتر میتواند مواد موثر در زعفران (از جمله کاروتنوئیدها) را بیرون بکشد. به ویژه که بسیاری از ترکیبات موجود در زعران نسبت به نور حساس هستند و با گذشت زمان تخریب میشوند. با این حال نقش اصلی اجزای موثر زعفران و سازوکار(های) مسئول فعالیت فارماکولوژیک MCSE نیازمند پژوهشهای بیشتر است با این حال مطالعات متعدد بر روی سلولهای جانوری نشان داده اند که زعفران و اجزای آن با مهار تولید رادیکالهای آزاد و تقویت فعالیت آنتی اکسیدانی به شیوهای وابسته به مسیر ERK1/2 نقشهای محافظت کنندهای در دستگاه عصبی ایفا میکنند (٢۴). از طرفی کروسین استخراج شده از زعفران به دلیل نقش آنتی اکسیدانی شناخته شده خود با افزایش سطح گلوتاتیون و مهار JNK مرگ سلولهای عصبی ناشی از استرس ایسکمیک را کاهش میدهد. به علاوه سافرانال، کروسین و کروستین با کاهش سطح مولکولهای نوروتوکسیک در میکروگلیهای فعال شده اثرات محافظت کنندگی عصبی خوبی به ویژه در هیپوکامپ نشان میدهند (٥).
بررسی بالینی منتشر شده توسط مشیری و همکاران در سال ٢۰١٥ درباره اثرات ضد آلزایمر زعفران حاکی از آن است که استفاده از زعفران در افراد مبتلا به آلزایمر در مقایسه با دارونما اثرات ضد آلزایمری و ضد افسردگی معنی داری داشته است (٢۰). نمود نقشهای محافظت کننده عصبی زعفران به صورت ممانعت از بروز تغییرات نوروپاتولوژیک در ناحیه هیپوکامپ و بهبودی متعاقب حافظه و یادگیری فضایی در موش از راه تنظیم کاهشی عوامل اکسید کننده هم در بعضی از پژوهشها نشان داده شده است. مشابه همین نتایج در زمینه نقش محافظت کننده عصبی زعفران د رانسان هم نشان داد شده است. بر همین اساس یک مطالعه بالینی آشکار کرده است که درمان با زعفران اثرات محافظت کننده عصبی کوتاه مدت و بلند مدت در بیماران مبتلا به سکته مغزی ایسکمیک دارد (٢۴).
در مجموع نتایج حاصل از این پژوهش پیشنهاد کننده آن است که عصاره متانولی زعفران دارای نقش محافظت کنندهای از دستگاه عصبی در برابر عودهای EAE و حملات آسیب رسان سامانه ایمنی به این دستگاه در موشها است که با توجه به شباهت این اثرات به اثر دگزامتازون پیشنهاد میشود که عصاره متانولی زعفران اثرات ضد التهابی مشخص دارد و با مهار روند التهاب که از ارکان اصلی اختلالات خود ایمنی از جمله EAE تجربی است سبب بهبود علائم این بیماری در موشهای مبتلا میگردد. مطالعات بیشتری در این راستا توسط این گروه پژوهشی انجام شده است که نتایج آن در آینده منشر خواهد شد.
تقدیر و تشکر:
هزینهها و امکانات آزمایشگاهی انجام این پژوهش توسط جناب آقای دکتر محمد حسین صنعتی و پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری فراهم گردید که بدینوسیله مراتب قدرانی خود را از ایشان اعلام میکنیم. همچنین لازم میدانیم تا به واسطه حمایتهای معنوی و در یک مورد حمایت مالی جهت خرید سم سیاه سرفه از سرکار خانم دکتر پروین رستمی سپاسگزاری نماییم.
References
1. Abdullaev F.I., Caballero-Ortega H, Riveron-Nigrete L, Pereda-miranda R, Rivera-Luna R, Manuel Hernandez J, Perez-Lopez I, Espinoza-Aguirre JJ. In vitro evaluation of chemopreventive potential of saffron. Rev Inves Clin. 2002a; (54):430-436
2. Abdullaev F.I., Cancer chemopreventive and tumoricidal properties of saffron (crocus sativus L.). Exptl Biol Med. 2002b; (227):20-25
3. Abe K, Sugiura M., Shoyama Y., Saito H., Crocin antagonizes ethanol inhibition of NMDA receptor-mediated responses in rat hippocampal neurons. Brain Research 1998; (787):132-138
4. . Abe K, Sugiura M., Yamaguchi S., Shoyama Y., Saito H., Saffron extract prevents acetaldehyde-induced inhibition of long-term potentiation in rat dendate gyrus in vivo. Brain Research 1999; (581):287-289
5. Azari H., Ebrahimi S., Saeb s., Ghanbari A., et al., The effect of saffron aquatic extract and crocin on the differentiation of Neuralstem cells into oligodendrocyte precursor cells. Shiraz E-Medical Journal 2018 March;19(3): e60190 doi: 10.5812/semj.60190
6. Deuvaux B., Enderlin F., Wallner B., Smilek DE., Induction of EAE with recombinent human MOG, and treatment of EAE with a MOG peptide. J Neuroimmunology 1997; (75):169-175
7. Escribano J., Diaz-Guerra M.J.M., Reise H.H., Ontanon J., Garcia-Olmo D., Garcia-Olmo D.C., Robio A., Fernandez J.A., IN vitro activation of macrophages by a novel proteoglycan isolated from corms of crocus sativus L. Cancer Letters 1999; (144):107-114
8. Faridi S., Delirezh N., Abtahi Froushani SM., beneficial effects of hydroalcoholic extract of saffron in alleviating experimental autoimmune diabetes in C57BL/6 mice. Iran J Allergy Asthma Immunol. 2019 February; 18(1):38-47
9. Gharagozloo M., Mace J.W., Calobresi P. A., Animal models to investigate the effects of inflammation on remyelination in multiple sclerosis. Frontiers in Molecular Neuroscience 2022 November; 01-10 doi:10.3389/fnmol.2022.995477
10. Ghazavi A., Mosayebi G., Salehi H., Abtahi H., Effects of ethanol extract of saffron (Crocus sativus L.) on inhibition of experimental autoimmune encephalomyelitis in C57Bl/6 mice. Pak J Biol. Sci. 2009 May; 12(9):690-695 doi:10.3023/pjbs.2009.690.695
11. Gilgun-Sherki Y., Panet H., Holdengerber V., Mosberg-Galili R., Offen D., Axonal damage is reduced following glatiramer acetate treatment in C57/bl mice with chronic–induced experimental autoimmune encephalomyelitis. Neuroscience research 2003; (47) 201-207
12. Gommerman J.L., Giza K., Perper S., Sizing I., Ngam-ek A., Nickerson-Nutter C., Browning J.L., A role for surface lymphotoxin in experimental autoimmune encephalomyelitis independent of LIGHT. J clin Invest. 2003; (112):755-767
13. Hosseinzadeh H., Khosravan V., Anticovulsant effects of aqueous and ethanolic extracts of Crocus sativus L. stigmas in mice. Arch Irn Med. 2002; (5):44-47
14. Hosseinzadeh H., Younesi H.M., Antinociceptive and anti-inflammatory effects of crocus sativus L. Stigma and petal extracts in mice. BMC Pharmacol. 2002; (2):1-8
15. Hosseinzadeh H., Karimi G.H., Niapoor M., Antidepressant effects of crocus sativus stigma extracts and its constituents, crocin and safranal in mice. Acta Hort (ISHS) 2004; (650) 435-45
16. Hosseinzadeh H., Sadeghnia H.R., Safranal, a constituent of Crocus sativus (saffron) attenuated cerebral ischemia induced oxidative damege in rat hippocampus. J Pharm Pharmaceut Sci. 2005; (8):394-399
17. leadbetter E.A., Bourque C.R., Devaux B., Olson C.D., Sunshine G.H., Hirani S., Wallner B.P., Smilek D.E., Happ M.P., Experimental autoimmune encephalomyelitis induced with a combination of myelin oligodendrocyte glycoprotein is ameliorated by administration of a single myelin basic protein peptide. J immunol. 1998; (161):405-512
18. Linares D, Mana P, Goodyear M, Chow AM, Clavarino C, Huntington ND, Barnett L, Koentgen F., Tomioka R., Bernard C.C.A., Freier-Garabal M., Reid H.H., The magnitude and encephalitogenic potential of autoimmune response to MOG is enhanced in MOG deficient mice. J Outoimmun. 2003; (21):339-351
19. . Martin R., McFarland H.F., Immunological aspects of experimental allergic encephalomyelitis and multiple sclerosis. Crit Rev in Clin Lab Sci. 1995;(32):121-182
20. Moshiri M., Vahabzadeh M., Hosseinzadeh H., Clinical application of saffron (Crocus sativus) and its constituents: A Review. Drug Res. (stuttg) 2015 Jun; 65(6):287-295
21. Nair S.C., Kurumboor S.K., Hasegawa J.H., Saffron chemopeventive in biology and medicine: a review. Cancer Biother. 1995; (10):257-264
22. Part E., Martin R., The immunopathogenesis of multiple sclerosis. J Rehablit Res Devl 2002; (39):187-199
23. Paul C., Bolton C., Inhibition of blood brain barrier disruption in experimental allergic encephalomyelitis by short-term therapy with dexamethasone or cyclosporin A. Int J Immunopharmac 1995; (17):497-503
24. Poursamimi J., Shariati-Sarabi Z., Tavakkol-Afshari J., Mohajeri SA., Mohamadi M., Crocus sativus (saffron): An immunoregulatory factor in the autoimmune and non-autoimmune diseases. Iran J Allergy Asthma Immunol 2020 May; 19(supple-1):28-42
25. Premkumar K., Abraham S.K., Santhiya S.T., Gopinath P.M., Ramesh A., Inhibition of genotixicity by saffron (Crocus sativus L.) in mice. Drug Chem Toxicol. 2001; (24):421-428
26. Premkumar K., Abraham S.K., Santhiya S.T., Ramesh A., protective effects of saffron (crocus sativus L.) on genotoxins-induced oxidative stress in swiss albino mice. Phytother Res. 2003; (17):614 –17
27. Probert L., Eugster H.P., Akassoglou K., Bauer J., Frei K., Lassmann H., Fontana A., TNFR1 signalling is critical for the development of demyelination and the limitation of T-cell responses during immune-mediated CNS disease. Brain 2000 (123):2005-2019
28. Rois J.L., Rico M.C., Ginger R.M., Manz S., An update review of saffron and its active constituents. Pytother Res. 1996 (10):189-193
29. Soeda S., Ochiai T., Paopong L., Tanaka H., Shoyama Y., Shimeno H., Crocin suppresses tumour necrosis factor-alpha-induced cell death of neuronally differentiated PC-12 cells. Life Sci. 2001 (69):2887-298
30. Voskuhl R.R., Mackenzie-Graham A., Chronic Experimental autoimmune encephalomyelitis is an excellent model to study neuroaxonal degeneration in multiple sclerosis. Frontiers in Molecular Neuroscience 2022 October; 01-12 doi; 103389/fnmol.2022.1024058
31. . Zargari M., Allameh A., Sanati M.H., Tiraihi T., Lavasani S., Emadyan O., Relationship between the clinical scoring and the demyelination in central nervous system with total antioxidant capacity of plasma during experimental autoimmune encephalomyelitis development in mice. Neurosci lett. 2007 (412):24-28
32. Zhang Y.X., Sugiura M., Saito H., Shoyama, Y., Acute effects of Crocus Sativus L.on passive avoidance performance in mice. Biol Pharmachol Bull. 1994 (17):217-221
An Investigation on the Effects of Methanol Extract of saffron on Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in C57BL/6 mice
Shamila Eslambolchi1, Mohamad H. Sanati2, Kamahldin Haghbin3
1-Biology Department, Faculty of Biology, Islamic Azad university- North Tehran Branch, Tehran, I. R. Iran
2-Medical Genetic Laboratory, Medical Genetic Department, National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology, Tehran, I. R. Iran
3-Biochemistry Laboratory, Plant bioproducts Department, National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology, Tehran, I. R. Iran
Correspondence author: Shamila Eslambolchi, seslambolchy@yahoo.com
Abstract
Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory demyelinating disease of central nervous system and commonly used as an animal model for multiple sclerosis (MS). Multiple sclerosis is a disabling neurodegenerative disease in human being. Inflammation is a key event in both EAE and MS, which leads to demyelination and subsequent disability. It is shown that crocus sativus L. stigma (saffron) extracts have anti-inflammatory activity in rats and mice. There are modern pharmacological evidences for anti-tumour, chemopreventive and genoprotective effects as well as radical scavenger properties of saffron extracts or its constituents. We observed that both therapeutic doses of dexamethasone and methanol extracts of saffron stigma at 100mg/kg and more prevented EAE from progression significantly in pMOG-immunized female C57BL/6 mice. Aqueous maceration extract of Crocus sativus L. did not prevent EAE progression. These results suggest that saffron may attenuate symptoms of EAE by its anti-inflammatory activity. Experimental data analyzed by one-way ANOVA.
Keywords: EAE, MS, SaffronMOG, C57BL/6 mice
