جداسازی باسیلوس سرئوس تولید کننده α-آمیلاز از ریزوسفر درختان پرتقال

محورهای موضوعی : باکتری شناسی

مهناز رمضانی ¹ , علی ریاحی مدوار ² , موج خالقی ³

1 - کارشناس ارشد، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد علوم و تحقیقات کرمان، گروه زیست شناسی
2 - استادیار، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته، پژوهشگاه علوم و تکنولوژی پیشرفته و علوم محیطی، پژوهشکده علوم محیطی، گروه بیوتکنولوژی
3 - استادیار، دانشکده علوم، دانشگاه شهید باهنر کرمان، گروه زیست شناسی

تاریخ دریافت : 1391/06/10 تاریخ پذیرش : 1392/02/04 تاریخ انتشار : 1392/03/11

کلید واژه: 16S rRNA, باسیلوس سرئوس, α-آمیلاز, ریزوسفر,

چکیده مقاله :

سابقه و هدف: : باکتری های موجود در ناحیه ریزوسفر با محلول نمودن فسفات و تولید ترکیباتی از قبیل فیتوهورمون ها و ترشح آنزیم هایی مانند α-آمیلاز و کیتیناز به رشد گیاهان کمک می‌نمایند. این مطالعه با هدف جداسازی و شناسایی باسیلوس‌های تولید کننده α-آمیلاز از ریزوسفر درختان پرتقال و نیز ارزیابی تولید و فعالیت α-آمیلاز در حضور منابع مختلف کربن و دامنه های مختلف pH انجام شد. مواد و روش ها: این پژوهش به صورت مقطعی به منظور جداسازی باسیلوس های تولید کننده α-آمیلاز از ریزوسفر باغات پرتقال دلفارد در استان کرمان انجام شد. پس از جمع آوری نمونه، به منظور جداسازی باکتری از محیط آگار حاوی نشاسته استفاده گردید. از آزمون‌های بیوشیمیایی و مولکولی تعیین توالی ناحیه 16S rRNA برای شناسایی دقیق سویه مورد نظر استفاده شد. به منظور بررسی فعالیت آمیلازی از تست سریع هیدرولیز نشاسته استفاده گردید. همچنین تولید آنزیم در حضور منابع مختلف کربن شامل گلوکز، فروکتوز و نشاسته مورد بررسی قرار گرفت. یافته ها: پس از شناسایی بیوشیمیایی و تعیین توالی سویه برتر تولید کننده آنزیم با عنوان باسیلوس سرئوس سویه MR-R3 با شماره دستیابی KC306945.1 در بانک جهانی ژن ثبت گردید. همچنین نتایج نشان داد که نشاسته و گلوکز بیشترین اثر مثبت بر تولید آنزیم α-آمیلاز را در غلظت 0/5 گرم بر لیتر و فروکتوز بیشترین اثر را در غلظت 0/25 گرم بر لیتر دارا می‌باشند. نتیجه گیری: با توجه به کفایت مناسب تولید α-آمیلاز سویه جداشده در شرایط آزمایشگاهی، انجام مطالعات های گسترده تر در حد بالاتر به منظور شناسایی دقیق تر ویژگی های آنزیمی آن پیشنهاد می گردد.

چکیده انگلیسی:

Background and Objectives: Rhizosphere bacteria assist growth of plants via dissolving phosphate, production of special compounds such as phytohormones and release of hydrolytic enzymes such as a-amylase and kitinase. This study aimed to isolate and to identify a a-amylase producing bacillus in rhizosphere of orange orchards and to investigate microbial activity to enzyme production in presence of different source of carbon ranges. Materials and Methods: This study was conducted in order to isolation of a-amylase bacilli from rhizosphere of orange orchards located at Kerman province, Iran. After sample collection, bacteria were isolated by growing on starch agar. Several molecular (based on 16SrRNA) and biochemical methods were used to identify bacterial species. The starch rapid hydrolysis test was used to investigate amylase activity of the isolates. Additionally, the enzyme production level was studied in the presence of several carbon sources include glucose, fructose and starch ranges. Results: Molecular and biochemical analysis showed that isolated bacterium is a strain of Bacillus cereus named as Bacillus cereus MR-R3 and recorded in GeneBank under accession number of KC306945.1. Moreover, results showed that starch and glucose have the highest positive effects on alpha amylase production in the presence of 0.5 g/l and fructose have the highest effect in the presence of 0.25 g/l. Conclusion: Isolation and identification of orange orchards rhizospher-derived bacillus species considering their ability to produce a-amylase and phosphate solvation showed that the presence of this species in this region is very important. Moreover, increase in production of the enzyme after treatment with different carbon sources can be related to their gene expression induction effects.

منابع و مأخذ:

1. Pandey P, Nigam CR, Soccol VT, Soccol D, Singh R. Advances in microbial amylases. Biotechnol Appl Biochem. 2000; 31(2): 135 -152.

2. Abu EA, Ado SA, James DB. Starch degrading amylase production by mixed culture of Aspergillus niger and Saccharomyces cerevisiae grown on Sorghum pomace. Afr J Biotechnol. 2005; 4(8): 785- 790.

3. Sun H, Zhao P, Ge X, Xia Y, Hao Z, Liu MP. Recent advances in microbial raw starch degrading enzymes. Appl Biochem Biotechnol. 2010; 160(4): 988-1003.

4. Oudjeriouat N, Moraiau Y, Santimone M, Svenssen B, Marchis-Mouren G. Desseaux V. On the mechanism of amylase: A carbon and cyclodextrin inhibition of barley amylase isoenzymes. Eur Biochem FEBS. 2003; 270: 3871-3879.

5. Oliveira AN, Oliveira LA, Andrade JS, Junior AF. Rhizobia amylase production using various starchy substances as carbon substrates. Brazil J Microbiol. 2007; 38(2): 208-216.

6. Raaijmakers JM, Paulitz CT, Steinberg C, Alabouvette C, Moe¨nne-Loccoz Y. The rhizosphere: a playground and battlefield for soil borne pathogens and beneficial microorganisms. Plant Soil. 2009; 321: 341-361.

7. Bloemberg GV, Lugtenberg JJ. Molecular basis of plant growth promotion and biocontrol by rhizobacteria. Curr Opin Plant Biol. 2001; 4(4): 343-350.

8. Pandey A, Soccol CR, Rodriguez-Leon JA, Nigam P. Solid state fermentation in biotechnology. JBM. 2001; 34(6): 405-423.

9. Fuwa H. A new method of micro-determination of amylase activity by the use of amylase as the substrate. J Biochem. 1954; 41: 583-603.

10. Holt JG, Krieg NR, Sneath PH, Staley JT, Williams ST. Bacilli. In Williams BW and Aidan CP 2th ed. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. 5-0-387-95041-9. USA. Baltimore. Springer Dordrecht Heidelberg London New York. 2009; 21-68.

11. Miller GL. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal Chem. 1959; 31(3): 426-428.

12. Krishna C, Chandrasekaran M. Banana waste as substrate for amylase production by Bacillus.subtilis (CBTK-106) under solid state fermentation. Appl Microbiol Biotechnol. 1996; 46(2): 106-111.

13. Robyt JF. Biodegradation. In Charles RC. Essentials of Carbohydrate Chemistry.1. 0-387-94951. Boston. Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg. 1998; 331-333.

14. Van der Marc JEC, Van der M, Bart-van der V, Uitdehaag JCM, Leemhuis H, Dijkhuizen L. Properties and applications of starch-converting enzymes of the a-amylase family. J Biotechnol. 2002; 94(2): 137-155.

 

15. Bozic N, Ruiz2 J, Santin Jl, Vujcic Z. Optimization of the growth and α-amylase production of Bacillus subtilis IP 5832 in shake flask and laboratory fermenter batch cultures. J Serb Chem Soc. 2011; 76(7): 965-972.

16. Anto H, Trivedi U, Patel K. Alpha amylase production by Bacillus cereus MTCC1305 using solid state fermentation. Food Technol Biotechnol. 2006; 44(2): 241-245.

17. Heseltine C, Rolfs Meier M, Blum P.  The  glucose  effect  and regulation  of  α-amylase  synthesis in the hyperthermophilic archaeon Sulfolobus solfataricus. J Bacteriol. 1996; 178(4): 945-950.

18. Srivastava R, Baruah JN. Culture conditions for production of thermostable amylase by Bacillus stearothermophilus. Appl Environ Microbiol. 1986; 52(1): 179-184.

19. Brown SH, Costantino HR, Kelly RM. Characterization of amylolytic enzyme activities associated with hyperthermophilic archibacterium, Pyrococus furiosus. Appl Environ  Microbiol. 1990; 56(7): 1985-1991.

20. Haseltine C, Rolfsmeier M, Blum P. The glucose effect and regulation of a-amylase synthesis in the hyperthermophilic archaeon Sulfolobus solfataricus. J Bacteriol. 1996; 178(4): 945-950.

21. Mulimani VH, Patil GN. α-amylase production by solid state fermentation: A new practical approach to biotechnology courses. Biochem Educe. 2000; 28(3): 161-163.

22. Fukumoto J, Yamamoto T, Tsuru D. Effect of carbon sources and base analogues of nucleic acid on the formation of bacterial amylase. Nature. 1957; 180(4583): 438-439.

23. Dharani-Aiyer PV. Effect of C: N ratio on alpha amylase production by Bacillus licheniformis SPT 27. Afr J Biotech. 2005; 3(10): 519-522.

24. Buonocore V, Caporale C, De Rosa M, Gambacorta A. A stable inducible thermoacidophilic α-amylase from Bacillus acidocaladarius. J Bacteriol. 1976; 128(2): 515-521.

25. Shafaat S, Akram M, Rehman A. Isolation and characterization of a thermostable-amylase from Bacillus subtilis. Afr J Microbiol Res. 2011; 5(20): 3334-3338.

26. Utong J, Al-Quadan F, Akel H. Effects of various growth conditions on the production of extracellular amylase from thermotolerant Bacillus sp isolated from hot spring in Jordan. J Biol Sci. 2006; 6(3): 621-625.