طراحی کنترل داخلی به منظور تشخیص مایکوباکتریوم توبرکیلوسیس در روش PCR

محورهای موضوعی : میکروب شناسی مولکولی

محمد حسن شاه حسینی ¹ (دانشیار، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد شهر قدس، گروه میکروب شناسی)
مریم قهری ² (کارشناس ارشد، موسسه ایرانیان ژن فناور، تهران)
الهام مسلمی ³ (استادیار، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تهران شرق، گروه میکروب شناسی)

تاریخ دریافت : 1392/10/22 تاریخ پذیرش : 1393/01/22 تاریخ انتشار : 1393/08/10

کلید واژه: PCR, مایکوباکتریوم توبرکیلوسیس, کنترل داخلی, رقابتی, PCR-Cloning,

چکیده مقاله :

سابقه و هدف: سل به عنوان دومین علت مرگ و میر ناشی از عفونت شناخته شده است. روش های مولکولی مانند PCR، تکنیک های مناسبی برای شناسایی مایکوباکتریوم توبرکیلوسیس (MTB) هستند. بروز نتایج متفاوت در آزمایشگاه های مختلف، از معایب این تکنیک مولکولی است. این مطالعه با هدف طراحی، ساخت و کاربرد کنترل داخلی در روش PCR به منظور تشخیص MTB انجام شد. مواد و روش ها: به منظور ساخت کنترل داخلی ویژه MTB ، ابتدا پرایمرهای ویژه آزمون PCR برای تشخیص مولکولی بهینه و سپس حساسیت و ویژگی آن مشخص گردید. پرایمرهای مرکب (Composite Primer) برای IC-MTB نیز طراحی، تکثیر و سپس کلون شد. IC-MTB تکثیر شده در پلاسمید pTZ57R الحاق و در باکتری اشریشیا کلی JM107 ترانسفورم و کلون گردید. تعداد حداقل IC در هر واکنش PCR از طریق رقیق سازی و همچنین طیف پاسخ PCR همراه با کنترل داخلی مورد بررسی قرار گرفت. یافته ها: اندازه محصول تشخیصی MTB با پرایمرهای اختصاصی آن برابر با 245 جفت باز و محصول IC-MTB برابر با 660 جفت باز بود. که از نظر اندازه، اختلاف مطلوب را با هم دارند. تعداد حداقل IC در هر واکنش 1000 عدد تعیین شد. حداقل و حداکثر حساسیت روش PCR همراه با IC برای DNA باکتری مایکوباکتریوم توبرکیلوسیس بین 10 میلیون تا 10 باکتری محاسبه گردید. در ارزیابی ویژگی با عوامل مختلف نیز هیچ محصول ناخواسته ای مشاهده نشد. نتیجه گیری: استفاده از یک کنترل داخلی در روش PCR می تواند خطاها را در آزمون تشخیص مولکولی مایکوباکتریوم توبرکیلوسیس شناسایی نماید. در واقع تکثیر IC نشان دهنده انجام صحیح تمامی مراحل تکثیر و تشخیص می باشد.

چکیده انگلیسی:

Background & Objectives: Tuberculosis is the second reason of deaths caused by known infectious agents. Although molecular approaches, such as PCR, are suitable techniques for detection of Mycobacterium tuberculosis (MTB), these techniques suffer of variable results in different laboratory conditions. This study aimed to design, manufacture and apply an internal PCR control used for detection of MTB. Materials & Methods: To produce special MTB internal control, first individual PCR test primers was optimized for molecular detection of MTB, and then their sensitivity and specificity were measured. The composite primer for IC-MTB was also designed, replicated and colonized. The amplified IC-MTB was ligated to pTZ57R plasmid and was transformed into E. coli JM107. The minimum IC number in each PCR reaction was studied using dilution and PCR response spectrum with IC.  Results: The size of MTB diagnostic products with individual primers and IC-MTB were was 245 bp and 660 bp, respectively, which is a suitable difference in the size aspect. Minimum IC number was identified 1000 for each reaction. Minimum and maximum sensitivity PCR test by IC for MTB DNA was determined 10 and 10 million bacteria, respectively. No unwanted products were observed in characteristic tests by different agents. Conclusion: Using an internal control as an inside control system we could detect the errors in MTB molecular diagnosis test. In fact, IC amplification is representative of correct procedure in amplification and detection steps.