Evaluation of the antibacterial property of Garden Thyme (Thymus vulgaris L.) essential oil following the experimental exposure of broilers to Salmonella Typhimurium (ATCC: 14028) and its ability to prevent tissue complications in the small Int
Subject Areas : Veterinary Clinical Pathology
Younes Anzabi
1
(Assistant Professor, Department of Pathobiology, Faculty of Veterinary Medicine, Tabriz Branch, Islamic Azad University, Tabriz, Iran.)
یوسف Doustar
2
(Assistant Professor, Department of Pathobiology, Faculty of Veterinary Medicine, Islamic Azad University- Tabriz Branch, Tabriz, Iran)
Shayan Doolat-Abadi
3
(D.V.M. Graduate, Faculty of Veterinary Medicine, Tabriz Medical Sciences, Islamic Azad University, Tabriz, Iran.)
Keywords: : Garden Thyme, Broiler Chickens, Salmonella Typhimurium, Experimental infection, Tissue complications,
Abstract :
In order to apply the use of plant essential oils in complementary medicine, it is necessary to investigate their effects in inhibiting the growth of pathogenic bacteria in the laboratory, animal model and also pay attention to their possible side effects. Therefore, the purpose of the present study was to investigate the antibacterial effects of garden thyme essential oil on Salmonella Typhimurium and to evaluate its ability to prevent possible side effects caused by experimental exposure to the mentioned bacterium. For this purpose, 35 pieces of 14-day-old male broiler chickens were divided into 5 groups of 7 including healthy control, gavage control, and experimental patient, treated with garden thyme essential oil and treated with Oxytetracycline. First day 0.5 ml of Salmonella Typhimurium microbial suspension and the next day, separately 1 ml of garden thyme essential oil and Oxytetracycline to all the chickens of the third to fifth groups and also 1 ml of sterile distilled water was gavage to the chickens of the second group twice a day with a time interval of 12 hours for 7 days. At the end of each stage, the microbial count of the stool samples was performed and at the end of the period, after the easy killing of the chickens, the pathological examination of the small intestine and liver samples of all birds was performed. The result is that the chickens that were treated with oxytetracycline had a significant decrease in the excretion and colonization of Salmonella Typhimurium.
آسیب‌شناسی درمانگاهی دامپزشکی دوره 17، شماره 4، پیاپی 68، زمستانه 1402، صفحات: 306-291
"مقاله پژوهشی: 1437"
ارزیابی خاصيت ضدباكتريائي اسانس آویشن باغی(Thymus vulgaris L.) و توانائي آن در ممانعت از عوارض بافتي در روده كوچك و کبد متعاقب مواجهه تجربی جوجههای گوشتی با سالمونلا تایفیموریوم (ATCC: 14028)
شايان دولتآبادي1، یونس انزابی2*، یوسف دوستار2
1-دانش‌آموخته دكتراي حرفهاي، دانشکده دامپزشكي، علوم پزشكي تبريز، دانشگاه آزاد اسلامی، تبریز، ایران.
2- دانشیار گروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی، علوم پزشكي تبريز، دانشگاه آزاد اسلامی، تبریز، ایران.
*نویسنده مسئول مکاتبات: anzabi@iaut.ac.ir
(دریافت مقاله: 22/7/1402 پذیرش نهایی: 3/11/1402)
چكيده
برای کاربردیکردن مصرف اسانس‌های گیاهی در طب مکمل، بررسی اثرات آنها در ممانعت از رشد باکتری‌های بیماری‌زا در محیط آزمایشگاهی، مدل حيواني و نيز توجه به عوارض جانبي احتمالي آنها ضروري است. لذا هدف از انجام مطالعه حاضر، بررسی اثرات ضدباکتریایی اسانس گیاه آویشن باغی بر سالمونلا تایفیموریوم و ارزيابي توانائي آن در ممانعت از عوارض احتمالي ناشي از مواجهه تجربي با باكتري مذكور بود. به اين منظور، تعداد 35 قطعه جوجه گوشتی 14 روزه نر به 5 گروه 7 تایی شامل شاهد سالم، کنترل گاواژ، بیمار تجربي، تیمارشده با اسانس آویشن باغی و تیمارشده با آنتيبيوتيك اکسیتتراسایکلین تقسیم شدند. طی دوره آزمایش تجربي، مقدار 5/0 میلیلیتر از سوسپانسيون ميكروبي باکتری سالمونلا تايفيموريوم و روز بعد، مقدار 1ميليليتر از اسانس آویشن باغي و آنتیبیوتیک اکسیتتراسایکلین، جداگانه به همه جوجههای گروههاي سوم تا پنجم و نیز مقدار 1 ميليليتر آب مقطر استريل به جوجههاي گروه دوم، دوبار در روز با فاصله زمانی 12 ساعت به مدت 7 روز، گاواژ شد. در انتهاي هر مرحله، شمارش ميكروبي نمونههاي مدفوع و در پايان دوره هم پس از آسانكشي جوجهها، آسيبشناسی بافتی نمونههاي روده كوچك و كبد همه پرندگان انجام شد. يافتهها در مورد نمونههاي گروه سوم دفع سالمونلا از مدفوع تا پايان دوره، در مورد نمونههاي گروه چهارم تا 4 روز پس از تلقیح باکتری و برای گروه پنجم، ریزش سالمونلا در مدفوع را تا 2 روز پس از تلقیح باکتری، مشخص كرد. نتیجه اینکه جوجههایی که با آنتیبیوتیک اکسیتتراسایکلین تیمار شدهبودند، کاهش معنیدارتری در میزان دفع و کلونیزاسیون سالمونلا تایفیموریوم داشتند.
كليدواژهها: آويشنباغي، جوجهگوشتي، سالمونلا تايفيموريوم، عفونت تجربي، عوارض بافتي.
مقدمه
چند میکروارگانیسم بيماريزا وجود دارد که شیوع بیماری از راه تماس و مصرف غذاهای با منشاء طیور، غالبا با آنها ارتباط دارد که یکی از شایعترین آنها باکتری سالمونلا اینتریکا است (Antunes et al., 2016) و براين اساس گوشت مرغ و تخممرغ آلوده از مهمترین منابع انتقال سالمونلوزيس به انسان میباشند (Miranzadeh et al., 2016; Azizpour, 2018; Haji Seyedtaghiya et al., 2021). گزارش‌شده كه سالمونلوزیس یکی از مهمترین بیماریهای عفونی مشترک انسان و حيوانات، با گستردگی جهانی است که مشکلات فراوانی را از نظر بهداشتی و اقتصادی در اكثر کشورها ایجاد مینماید (Little et al., 2006; Jafari et al., 2017). در یک تقسیمبندی اپیدمیولوژیکی، انواع سروتیپهای بيماريزاي سالمونلا در طيور، به ۲ گروه سالمونلاهای تیفوئیدی و غیرتیفوئیدی دستهبندی شدهاند (Azizpour, 2018; Ferrari et al., 2019). سالمونلاهای غیرتیفوئیدی در انسان از اهمیت ویژهای برخوردار بوده و میتوانند موجب ایجاد عفونت و یا بیماری بالینی شوند. همچنين در افراد پیر، خردسال و دچار ضعف سیستم ایمنی، فرم شدید بیماری و باکتریمی مشاهده میشود که حتی میتواند در نهایت منجر به مرگ نيز گردند (Fardous and Shamsuzzaman, 2015; Azizpour, 2018). طی سال‌های اخیر برخی سالمونلاهای غیرتیفوئیدی طیور، از جمله سالمونلا تایفیموریوم و سالمونلا اینتریتیدیس به عنوان شایعترین سروتیپهای بیماریزای غذازاد گزارش شدهاند که از نظر بهداشت عمومی در جوامع انسانی از اهمیت ویژهای برخوردار میباشند (Harsha et al., 2011; Esmaeili and Hamedi, 2014; Villagran-de la Mora et al., 2020).
امروزه در بسیاری از کشورها مقابله با بیماری سالمونلوزیس بیشتر متکی بر استفاده از ترکیبات ضد باکتریایی است ولي درعين حال، به دلیل افزایش مصرف بیرویه آنتیبیوتیکها در سطح مزارع پرورشي طیور و نيز مراکز درمانی دامپزشكي، مقاومت عامل بیماری مذكور، نسبت به ترکیبات دارویی افزایش یافته و درمان آن را با مشکل مواجه کرده‌است، به طوری که میتوان گفت پیدایش و گسترش مقاومت باکتریها بهویژه انواع سروتیپهای سالمونلا نسبت به آنتیبیوتیکها، به یک معضل جهانی تبدیل شدهاست (Amirmozaffari et al., 2016; Rezaee et al., 2020)، از این رو محققان به سمت جایگزین‌های گیاهی روی آورده‌اند که ضمن دارا بودن اثرات ضدباکتریایی، فاقد عوارض جانبی ناشی از مصرف داروهای شیمیایی هستند. براين اساس ملاحظه ميگردد كه نسبت تعداد داروهای گیاهی مورد استفاده در درمان بیماری‌ها در مقایسه با تعداد کل داروهای رسمی در جهان در حال فزونی است. این نسبت در کشور‌هایی همچون چین و هند با حدود بیش از 70 درصد در بالاترین مقدار و در کشور‌هایی همچون ایالات متحده با حدود 20 درصد در حد نسبتاً پایینی قرار دارد. در اين راستا بعضی از اسانس‌های گیاهي به عنوان عوامل مهم ضدمیکروبی طبیعی گزارش شدهاند (Bart, 2004).
اسانس‌ها مایعات روغنی معطری هستند که از اندام‌های مختلف گیاهان نظیر دانه، ریشه، جوانه، پوست، شاخه، برگ، غنچه و گل بهدست می‌آیند. اسانس‌ها میتوانند تا بیش از 60 نوع ترکیب داشته باشند و ترکیبات اصلی موجود در آنها ممکن است تا 85 درصد تركيبات تشكيلدهنده اسانس را تشکیل دهند. البته گزارشات نشان ميدهند كه به طور عمده ترکیبات فنلی مسئول خواص ضدمیکروبی اغلب اسانس‌هاي گياهي هستند، هرچند نتیجه بعضی از بررسی‌ها نشانگر این موضوع است که اثرات ضدباکتریایی اسانس‌ها به صورت کامل، نسبت به اثرات تکتک اجزاء آن، بیشتر است. مشخص شده كه اكثر اسانس‌ها با داشتن خاصیت آبگریزی، موجب نفوذ در لیپید غشایی سلول باکتریها شده و متعاقباً منجر به خارج شدن یون‌ها و محتویات سلولی از آن می‌شوند و خروج این مواد از سلول، با ایجاد اختلال در عملکرد سلولی، باعث مرگ آنها میشود (Bagamboula et al., 2004).
آویشن باغی(Thymus vulgaris) جزء خانواده نعناعیان (لامیاسه) بوده و از گیاهان بومی ایران ميباشد که به طور سنتی به عنوان افزودنی و چاشنی، غالبا به انواع مواد غذایی اضافه میشود. اندام دارویی این گیاه، برگ و گل‌های آن است و از ترکیبات اصلی موجود در اسانس این گیاه، کارواکرول (Carvacrol)، تیمول (Thymol)، لینالول (Linalool) و پارا- سیمن (Para-Cymene) بوده که اثرات ضدمیکروبی آنها قبلا به اثبات رسیده و گزارش شده که اسانس آویشن باغی به دلیل داشتن ترکیبات مونوترپنی‌فنلی، یکی از موثرترین اسانس‌های گیاهی با خاصیت آنتی‌اکسیدانی و ضدمیکروبی به شمار می‌رود. تیمول هم یکی از مهمترین ترکیبات مونوترپنی اکسیژنه با خاصیت ضدباکتریایی، ضدقارچی و جلوگیری کننده از رشد آنها و نیز مایکوتوکسینها است (Nickavar et al., 2005).
با توجه به اينكه برای کاربردی کردن مصرف اسانس‌های گیاهی در طب مکمل، ابتدا بررسی اثرات ضدمیکروبی آنها در ممانعت از رشد باکتری‌های بیماری‌زا در محیط آزمایشگاهی و مدل حيواني ضرورت دارد و از طرف ديگر بايستي در عين حال به عوارض جانبي احتمالي آنها نيز توجه ويژه انجام گيرد، لذا هدف از انجام مطالعه حاضر، بررسی اثرات ضدباکتریایی اسانس گیاه آویشن باغی بر سویه استاندارد باکتری سالمونلا تایفیموریوم (ATCC:14028) و ارزيابي توانائي آن در ممانعت از عوارض احتمالي ناشي از مواجهه تجربي با باكتري مذكور بود.
مواد و روشها
- حيوانات استفادهشده و گروهبندي آنها: به منظور انجام تحقيق تجربي حاضر در يك بازه زمانی سه ماهه در پائيز 1401، تعداد 35 قطعه جوجه گوشتی 14 روزه نر نژاد راس از یکی از مزارع مرغ مادر شهرستان اهر (استان آذربایجانشرقي) خریداری شد. وزن تمامی جوجهها در روز اول بوسیله ترازو اندازهگیری شد و میانگین وزن جوجهها كه حدود 150 گرم بود، ثبت گردید. در ادامه جوجهها در 5 گروه 7 تایی به صورت تصادفي تقسیمبندی شدند كه گروه اول بهعنوان شاهد سالم، گروه دوم بهعنوان کنترل سالم برای گاواژ، گروه سوم بهعنوان بیمار تجربي، گروه چهارم بهعنوان بیمار تجربي تیمارشده با اسانس آویشن، گروه پنجم بهعنوان بیمار تجربي تیمارشده با آنتيبيوتيك اکسیتتراسایکلین در نظر گرفته شدند. آب و غذا به صورت آزاد در دسترس جوجه ها قرار گرفت و دمای محیط نگهداری جوجهها، در محدوده 36 درجه سلسيوس تنظیم شد. همچنین برای تهویه هوای محیط، دستگاه هواده و هواکش مناسب تعبیه شد.
لازم به ذکر است که در طی انجام مطالعه حاضر، كليه پروتكل‌هاي لازم كار بر روي مدل حيوانات آزمايشگاهي و نیز همه ملاحظات اخلاقي مورد تائيد كميته نظارت بر حقوق حيوانات آزمايشگاهي رعایت گردید.
در روز دوم دوره تحقيق، از جوجههاي همه گروههاي مورد آزمايش، نمونه مدفوع مقعدی بوسیله سواب استریل تهيه شده و بلافاصله در ظروف مخصوص نمونهبرداری (cool box)، به آزمایشگاه ميكروبشناسي دانشكده دامپزشكي دانشگاه آزاد اسلامي علوم پزشكي تبريز به منظور اثبات عدم وجود سالمونلا در آنها ارسال گردید. بلافاصله نمونههاي مدفوع ابتدا در پپتون بافر فسفاته حل شده، سپس به محيط مايع تتراتیونات منتقل شده و به مدت حدود 24ساعت در دماي 37 درجه سلسيوس گرمخانهگذاري شدند. در ادامه عمل سانتریفیوژ با شتاب ×g2500، به مدت 10 دقیقه انجام شده و پس از حذف مایع رویی، از رسوب باقی مانده هر نمونه، جداگانه بر روی محیط کشت XLD کشت خطی دادهشده و به مدت 24 ساعت در دماي 37 درجه سلسيوس گرمخانهگذاري گرديدند (Chand, 2013; Eslami et al., 2022). لازم به ذكر است كه پس از اخذ نمونه مدفوع، هر روز بستر جوجهها تمیز میشد تا نمونههای مدفوع مربوط به روزهاي مختلف دوره آزمايش، با يكديگر مخلوط نشوند.
- نحوه ايجاد عفونت تجربي در جوجههاي گوشتي مورد آزمايش: در مرحله ايجاد عفونت تجربي، مقدار 5/0 میلیلیتر از سوسپانسيون ميكروبي با غلظت معادل یک مکفارلند (3×108 cells/mL)، تهيه شده از كشت تازه باکتری سالمونلا تايفيموريوم (ATCC:14028) که با سفارش به مركز كلكسيون میکروارگانیسمهاي صنعتی سازمان پژوهشهای علمی و صنعتی ایران (تهران، ایران) خریداری شدهبود، به همه جوجههای گروههاي سوم تا پنجم گاواژ شد. 24 ساعت پس از تلقیح باکتری، مجددا یک گرم نمونه مدفوع از حيوانات تمامی گروههاي مورد آزمايش اخذ شده و برای تایید آلودگی در گروههای سوم تا پنجم و عدم آلودگی در گروههاي شاهد و کنترل گاواژ، در ظروف مخصوص نمونهبرداری (cool box)، به آزمایشگاه میکروبشناسی ارسال شد. باز هم ابتدا نمونههاي مدفوع در پپتون بافر فسفاته حل شده، سپس به محيط مايع تتراتیونات منتقل شده و به مدت حدود 24ساعت در دماي 37 درجه سلسيوس گرمخانهگذاري شدند و در ادامه عمل سانتریفیوژ با سرعت 2500 دور در دقيقه، به مدت 10 دقیقه انجام شده و پس از حذف مایع رویی، از رسوب باقی مانده هر نمونه، جداگانه بر روی محیط کشت XLD کشت خطی دادهشده و به مدت 24 ساعت در دماي 37 درجه سلسيوس گرمخانهگذاري گرديدند (Eslami et al., 2022). توضيح اينكه همه مواد مصرفي استفاده شده در اين بخش كار، ساخت شركت مرك- آلمان بود. پس از تایید ایجاد آلودگی تجربي در جوجههاي مورد نظر، تیمار جوجههاي گروههای چهارم و پنجم آغاز شد.
- نحوه آمادهسازي مواد لازم براي تيمار جوجههاي مورد آزمايش: بدين منظور ابتدا برگ گیاه آویشن باغی از یکی از عطاری‌های شهر تبریز خریداری و با مراجعه به هرباريوم دانشكده كشاورزي دانشگاه تبريز، هويت علمي گياه تهيه شده، تائيد گرديد. در ادامه برگهاي فوق به آزمايشگاه بهداشت موادغذائي دانشكده دامپزشكي دانشگاه آزاد اسلامي علوم پزشكي تبريز منتقل شده و پس از اينكه بتدريج در سایه كاملا خشک گرديد، به كمك آسياب برقي آزمايشگاهي، بصورت پودر درآمد. سپس استخراج اسانس گیاه فوق‌الذکر به روش تقطیر با بخار آب توسط دستگاه کلونجر شرکت آزما تجهیز (تهران، ایران) انجام شد. بدین منظور، 60 گرم از پودر تهيه شده از گیاه، به یک بالن منتقل شده و سپس مقدار 300 میلیلیتر نیز آب مقطر (به نسبت 1 به 5) در بالن دیگری اضافه ميشد. عملیات اسانس‌گیری حدود 3 ساعت به طول انجامیده و در نهايت اسانس خالص گیاه توسط قیف دکانتور جمعآوری و به طور جداگانه در داخل شیشه سربسته ریخته شده و تا زمان انجام آزمايشات مورد نظر، در يخچال4 درجهء سلسيوس نگهداری گرديد (Manandhar et al, 2018). همچنين برای تهیه محلول لازم از آنتیبیوتیک اکسیتتراسایکلین (رویاندارو، ایران) با میزان ماده موثره 200 میلی‌گرم/گرم، پس از خريداري آن از يكي از داروخانههاي دامپزشكي شهر تبريز، ابتدا بوسیله هاون چيني استريل، پودر لازم از آن تهيه شده و سپس مقدار یک گرم از پودر مذكور را داخل 100 میلیلیتر آب مقطر استريل حل کرده و محلولی یکنواخت تهیه كرديم.
- نحوه تيمار جوجههاي گوشتي مورد نظر
بدين منظور، جداگانه مقدار 1ميليليتر از اسانس آویشن باغي و آنتیبیوتیک اکسیتتراسایکلین(رویان دارو، ایران) با میزان ماده موثره 200 میلی‌گرم/گرم، دوبار در روز با فاصله زمانی 12 ساعت به مدت 7 روز به جوجههاي گروههای چهارم و پنجم، گاواژ شد(Eslami et al., 2022). برای بررسی تاثیرات احتمالی گاواژ بر رفتار و یا احتمال انتقال آلودگی، به حيوانات گروه دوم (کنترل گاواژ) نیز مقدار1 ميليليتر آب مقطر استريل، در هر نوبت تیمار، گاواژ ميشد. همچنين نمونههای مدفوع برای انتقال به آزمایشگاه ميكروبشناسي، 24 ساعت پس از هر تیمار در ظروف مناسب تمیز، خشک و بدون مواد ضدعفونیکننده و دارای دهانه پهن جمعآوری ميشدند. مراحل غنیسازی و کشت نمونهها هم مشابه مراحل قبلي ارائه شده در تحقيق، انجام ميگرديد (Chand, 2013; Eslami et al., 2022). در پایان دوره، مجددا وزن جوجهها برای کنترل میزان تاثیر بیماری از يكطرف و از طرف ديگر اثرات اسانس و آنتیبیوتیک اندازهگیری شد. همچنين در خاتمه دوره پرورشي تجربي، تمام جوجهها با تزریق عضلانی کتامین با دوز ml/kg33/0 و زایلازین با دوز ml/kg 13/0 بیهوش شده و با انجام جابجائي(dislocation) مهرههای گردن، بدون درد، عمل آسان کشی انجام شده و بلافاصله براي انجام مطالعات آسيبشناسی در بافتهای موردنظر، استفاده گرديدند. توضيح اينكه همه مواد مصرفي استفاده شده در اين بخش كار هم، ساخت شركت مرك- آلمان بود.
- نحوه انجام بررسي آسيب بافتي در جوجههاي مورد آزمايش: در اين مرحله برای بررسي وجود آسیب در بافت روده، حدود یک سانتیمتر از قسمت میانی روده باریک طیور مورد مطالعه همه گروههای تحقيق را جدا کرده و در فرمالین بافری 10درصد پايدار نمودیم. در ادامه از نمونههاي فوق با استفاده از شيوه‌هاي رايج پاساژ بافت و تهيه مقاطع هيستوپاتولوژيكي، برش‌هايي با ضخامت 5 ميكرون تهيه کرده و پس از انجام رنگآميزي هماتوکسیلین- ائوزین، آسيبهاي موجود در بافت روده با استفاده از بزرگنمايي 120× و در 5 ميدان ميکروسکوپي از هر برش و به‌طور تصادفي، با استفاده از ميكروسكوپ نوري Nikon مدل ECLIPSE E200، (ساخت كشور ژاپن) بررسي گرديدند (Lee and Luna., 1988). شدت آسیبها در روده هم توسط یک مقیاس نیمهکمی (semiquantitative scale) دوسو كور، براساس روش ارائهشده توسط گلكون و همکاران درسال 2010 ارزیابی شد. براين اساس، وضعیت پرزهای روده در هر حیوان به صورت: صفر، طبیعی؛ 1، کوتاه شدن ملایم؛ 2، کوتاه شدن متوسط؛ 3، کوتاه شدن شدید و 4، مشاهده نشدن پرز، درجهبندی شد. همچنين وضعیت مخاط روده به صورت: صفر، طبیعی؛ 1، جداشدن اپیتلیوم مخاط و خونریزی کانونی و ملایم؛ 2، ازبین رفتن کامل اپیتلیوم مخاط و خونریزی متوسط؛ 3، ازبین رفتن کامل پرز و خونریزی گسترده و شدید و 4، تخریب لایه عضلانی درجهبندی شد. میزان آماس نيز به صورت: صفر، طبیعی؛ 1، ارتشاح کانونی سلولهای آماسی؛ 2، ارتشاح جزئی سلولهای آماسی فقط در لامیناپروپریا، 3، آماس روده در لامیناپروپریا و 4، آماس شدید روده که به لایه عضلانی نیزگسترش یافته است، درجهبندی شد (Gulgun et al., 2010). توضيح اينكه همه مواد مصرفي استفاده شده در اين بخش كار، ساخت شركت مرك- آلمان بود.
از طرف ديگر برای مطالعه آسیب بافتی در کبد، قسمتی از بافت کبد طیور همه گروههای تحقيق، جدا گردیده و جهت ثبوت در فرمالين بافري 10 درصد قرار داده شد. از نمونههاي فوق با استفاده از شيوه‌هاي رايج پاساژ بافت و تهيه مقاطع هيستوپاتولوژي، برش‌هايي با ضخامت 5 ميكرون و با روش رنگآميزي هماتوكسيلين- ائوزين تهيه شد و در ادامه آسيبهاي موجود در بافت کبد با استفاده از بزرگنمايي 120× و در 5 ميدان ميکروسکوپي از هر برش و به‌طور تصادفي، با استفاده از ميكروسكوپ نوري Nikon مدل ECLIPSE E200 (ساخت كشور ژاپن) بررسي گرديدند (Lee and Luna., 1988). شدت آسیب کبد بر اساس یک مقیاس دوسو کور (semiquantitative scale) نیمهکمی و طبق روش ارائه شده توسط فري و همکاران ارزیابی گردید که بر اين اساس شدت آسیبهای مشاهده شده، از صفر تا 4 (صفر: عدم وجود آسیب، 1: حداقل آسیب، 2: آسیب ملایم، 3: آسیب متوسط و 4: آسیب شدید) رتبه‌بندي شد (Frei et al., 1984). همه مواد مصرفي استفاده شده در اين بخش كار هم، ساخت شركت مرك- آلمان بود.
-تحلیل آماری دادهها: براي تحليل دادهها از بسته نرم‌افزاري SPSS نسخه 19 استفاده شد. براي مقايسه درجات آسیب بافتهای کبد و روده طیور بين گروههاي مورد مطالعه، پس اطمینان از نرمال بودن توزیع دادهها با استفاده از آزمون آماري كالموگروف–اسميرنف (Kolmogorov-Smirnov)، از آزمون ناپارامتري کروسکال واليس (Kruskal-Wallis H test) استفاده شد که در صورت معنيدار بودن آزمون فوق، با استفاده از آزمون ناپارامتري يو مان-ويتني (Mann-Whitney U test) با اصلاح بونفروني (Bonferroni Correction) مقايسات زوجي انجام شد. همچنين اختلافات آماري مشاهده شده در سطح 05/0p<، معنيدار تلقي شدند.
يافتهها
-نتايج بررسي ميكروبيولوژيكي نمونههاي مدفوع
مطابق يافتههاي بخش ميكروبشناسي تحقيق حاضر، در نمونه مدفوع هیچيك از جوجهها قبل از شروع دوره آزمایش، حضور سالمونلا تایفیموریوم مشاهده نشد. همچنين در مجموع، تعداد 35 نمونه مدفوع در طی 7 روز اول دوره آزمایش تجربي از 5 گروه مورد مطالعه جمع آوری و به آزمایشگاه انتقال داده شد كه حاصل كار شامل 27 مورد منفی (15 مورد مربوط به گروههای شاهد سالم بود که نشان دهنده عدم آلودگی توسط گروه های بیمار تا پایان آزمایش بود و 12 مورد مربوط به عدم دفع سالمونلا در مدفوع از گروههای آلوده بود) و 8 مورد مثبت بود.
-نتايج بررسي باليني پرندگان گروههاي تيمار
پس از ايجاد آلودگی تجربي در تحقيق حاضر، در روزهای 2، 3 و 5 پس از آن، اسهال آبکی در جوجههاي گروههای 4 و 5 مشاهده شد. در جوجههاي گروه 3 (شاهد بيمار) نيز دفع مدفوع از نظر غلظت به صورت نرمال و مطابق وضعيت مشاهده شده در مورد پرندگان گروههای شاهد (گروههاي 1 و 2) بود، البته میزان دفع مدفوع توسط جوجههاي گروه مذكور، پس از ایجاد آلودگی کاهش یافت. از طرف ديگر میزان حجم غذای مصرفی توسط پرندگان دریافتکننده آنتیبیوتیک نسبت به گروههای شاهد افزایش یافت، درحاليكه حجم غذای مصرفی جوجههاي 2 گروه ديگر فوق، پس از آلودگی، نسبت به گروه شاهد کمتر شد. همچنين مصرف آب جوجههاي دریافت کننده آنتیبیوتیک هم در مقایسه با پرندگان گروه شاهد افزایش داشت. همچنین لازم به ذكر است كه هیچ علامتی از بیحالی و افسردگی در هیچکدام از گروههای دریافتکننده باکتری دیده نشد. هیچ واکنشی نيز علیه عمل گاواژ، در جوجههاي گروه دوم مشاهده نشد.
-نتايج بررسي ميكروبيولوژيكي نمونههاي مدفوع پرندگان گروههاي تيمار
با توجه به اينكه پس از تایید ایجاد آلودگی تجربي بهوسیله سالمونلا تایفیموریوم در جوجههای گروههای سوم تا پنجم توسط کشت میکروبی، شمارش باکتری‌هاي مذكور در نمونههاي مدفوع، 24 ساعت پس از شروع تیمار آغاز و تا 8 روز (روز پانزدهم دوره تحقيق)، بطور روزانه ادامه یافت. يافتهها در مورد نمونههاي گروه سوم (گروه شاهد بيمار تجربي) دفع سالمونلا از مدفوع را تا پايان دوره، در مورد جوجههای گروه چهارم (تیمارشده با آویشن) تا 4 روز پس از تلقیح باکتری و برای جوجههای گروه پنجم (تیمار شده با اکسیسایکلین)، ریزش سالمونلا از مدفوع را تا 2 روز پس از تلقیح باکتری، مشخص كرد. در واقع مشاهده گرديد كه میزان مقاومت سالمونلا تایفیموریوم به آویشن به مراتب بیشتر از اکسیتتراسایکلین ميباشد و جوجههایی که با آنتیبیوتیک اکسیتتراسایکلین تیمار شدهبودند نسبت به جوجههایی که با اسانس آویشن باغی تیمار شدهبودند و نيز گروه شاهد بيمار، کاهش معنیداری در میزان دفع و کلونیزاسیون سالمونلا تایفیموریوم داشتند (جدول 1).
جدول 1- تعداد کلنیهای مشاهدهشده سالمونلا تایفیموریوم پس از کشت مدفوع جوجههای گوشتی مورد آزمایش در گروههای عفونت تجربي و دریافت کننده تیمار
زمان طيشده از عفونت تجربي (ساعت) | 24 | 48 | 72 | 96 | 120 | 144 | 168 | 196 |
نتيجه شمارش ميكروبي گروه مورد نظر | تعداد كلني # (cfu/g) | تعداد كلني # (cfu/g) | تعداد كلني # (cfu/g) | تعداد كلني # (cfu/g) | تعداد كلني # (cfu/g) | تعداد كلني # (cfu/g) | تعداد كلني # (cfu/g) | تعداد كلني # (cfu/g) |
سوم (عفونت تجربي) | 108× 2/1 | 108× 8/1 | 108× 2/5 | 108× 6 | 107× 3 | 106× 5/2 | 108× 4/1 | 108× 8/6 |
چهارم( تيمار با اسانس آويشن) | 108× 9/0 | 106× 1/5 | 103× 9 | 101× 1 | (-) | (-) | (-) | (-) |
پنجم( تيمار با اكسيتتراسايكلين) | 107× 5/1 | 105× 2/1 | (-) | (-) | (-) | (-) | (-) | (-) |
# Colony Forming Unit =cfu
علامت(-) به معني عدم مشاهده کلنی است.
-نتایج مربوط به بررسیهای آسيبشناسی بافتي
یافتههای بررسی ریزبینی از بافت روده باریک پرندگان گروه شاهد سالم، مشخص کرد که بافت مذکور کاملاً سالم و طبیعی بود (شکل 1).
همچنین در بررسی میکروسکوپیک بافت روده باریک جوجههای گروه شاهد گاواژ هم آسیب بافتی قابل مشاهده نگردید (شکل 2).
در مشاهدات ریزبینی بافت روده باریک پرندگان گروه مواجههیافته با باكتري سالمونلا، آسیبهائی شامل نکروز و جدا شدن بافت پوششی مخاط روده، تخریب پرزها و خونریزی همراه با حضور فراوان سلولهای آماسی در مخاط بافت روده باریک مشاهده شد (شکل 3).
از طرف دیگر مشاهدات ریزبینی بافت روده باریک جوجههای گروه مواجههیافته با باکتری سالمونلا که با اسانس آویشن باغی تیمار شده بودند، نشان داد که از شدت پرخونی، خونریزی و نکروز و تخریب پرزهای روده در این گروه نسبت به پرندگان گروه شاهد بیمار کاسته شده است (شکل 4).
همچنین نمای ریزبینی از بافت روده باریک پرندگان گروه مواجههیافته با باکتری سالمونلا، تیمار شده با آنتیبیوتیک اکسیتتراسایکلین هم مشخص کرد که از تغییرات پاتولوژیک در حیوانات این گروه بهوضوح کاسته شده، بهطوریکه ساختار بافت روده آنها به حالت طبیعی خود نزدیک شدهاست (شکل 5).
در جدول 2 شدت آسیبهای بافتی در روده باریک پرندگان گروههای مختلف مورد مطالعه بهصورت مقایسهای ارائه شدهاست.
از طرف دیگر، بر اساس مشاهدات ریزبینی بافت کبد جوجههای گروه شاهد سالم، مشخص گردید که بافت کبد پرندگان این گروه، کاملاً سالم و طبیعی است (شکل 6).
همچنین نمای ریزبینی از بافت کبد حیوانات گروه شاهد گاواژ هم نشان داد که آسیب بافتی قابل ملاحظهای در بافت مذکور، مشاهده نمی‌شود (شکل 7).
اما نمای ریزبینی از بافت کبد پرندگان گروه مواجههیافته با باکتری سالمونلا، تغييرات شديد دژنراتیو و نکروز در نواحي مركز لوبولي كه تا نواحي پورتال كشيده شده را نشان داد (شکل 8).
از طرف دیگر نمای ریزبینی از بافت کبد پرندگان گروه مواجههیافته با باکتری سالمونلا که با اسانس آویشن باغی تیمار شده بودند هم نشان داد که از شدت پرخونی، تغییرات دژنراتیو و نکروز، نسبت به بافت کبد در جوجههای گروه شاهد بیمار کاسته شدهاست (شکل 9).
همچنین مطابق یافتههای مشاهدات ریزبینی بافت کبد پرندگان گروه مواجههیافته با باکتری سالمونلا و تیمارشده با آنتیبیوتیک اکسیتتراسایکلین، مشخص گردید که از وقوع صدمات بافتی ناشی از مواجهه با باکتری مذکور در کبد به خوبی جلوگیری شده و آسيب بافتي فقط به شكل پرخونی جزئی و تغییرات دژنراتیو خفيف مشاهده میگردد (شکل 10).
در جدول 3 نیز شدت آسیبهای بافتی در کبد پرندگان گروههای مختلف بصورت مقایسهای ارائه شدهاست.
شکل 1- نمای ریزبینی از بافت روده باریک در گروه شاهد سالم که نشان میدهد، بافت روده باریک کاملاً سالم و طبیعی است
(رنگآمیزی هماتوکسیلین-ائوزین، درشتنمایی ×120).
شکل 2 - نمای ریزبینی از بافت روده باریک در گروه شاهد گاواژ که در آن آسیب بافتی قابل ملاحظهای مشاهده نمی‌شود
(رنگآمیزی هماتوکسیلین-ائوزین، درشتنمایی ×120).
شکل 3- نمای ریزبینی از بافت روده باریک در گروه مواجههیافته با باكتري سالمونلا. نکروز و جدا شدن بافت پوششی مخاط روده و تخریب پرزها (پیکان) و خونریزی (نوک پیکانها) همراه با حضور فراوان سلولهای آماسی در مخاط بافت روده باریک مشاهده میشود
(رنگآمیزی هماتوکسیلین-ائوزین، درشتنمایی ×120).
شکل 4- نمای ریزبینی از بافت روده باریک گروه مواجههیافته با باکتری سالمونلا بهعلاوه تیمار با عصاره آویشن که نشان میدهد از شدت پرخونی، خونریزی و نکروز و تخریب پرزهای روده در این گروه نسبت به گروه شاهد بیمار کاسته شده است. ارتشاح فراوان سلولهای آماسی و کیستیک شدن غدد لیبرکون در این تصویر کاملاً مشخص است (رنگآمیزی هماتوکسیلین-ائوزین، درشتنمایی ×120).
شکل 5- نمای ریزبینی از بافت روده باریک گروه مواجههیافته با باکتری سالمونلا بهعلاوه تیمار با آنتیبیوتیک اکسیتتراسایکلین. ملاحظه میگردد که از تغییرات پاتولوژیک در این گروه بهوضوح کاسته شده و ساختار بافت روده به حالت طبیعی خود نزدیک است. البته، کاهش جزئی ارتفاع پرزها، حضور اندک سلولهای آماسی و ادم خفیف در بافت مخاط روده باریک قابل مشاهده است (رنگآمیزی هماتوکسیلین-ائوزین، درشتنمایی ×120).
جدول 2- مقایسه شدت آسیب بافت روده در بین گروههای مورد مطالعه (مقادیر بهصورت ميانگين ± انحراف استاندارد در هر گروه ارائه شده است)
گروه مورد آزمايش | شدت آسیب در بافت روده باریک | ||||||
کاهش ارتفاع پرزها | آماس | زخم و خونریزی | |||||
1) شاهد سالم | 0/0±00/0 | 0/0±00/0 | 0/0±00/0 | ||||
2) شاهد گاواژ | 0/0±00/0 | 0/0±00/0 | 0/0±00/0 | ||||
3) شاهد بیمار (مواجههیافته با باكتري سالمونلا) | ***11/0±97/2 | ***22/0±95/3 | ***24/0±07/3 | ||||
4) مواجههیافته با باكتري سالمونلا+ تیمار با عصاره آویشن | **#08/0±18/1 | **19/0±01/3 | **#18/0±69/2 | ||||
5) مواجههیافته با باكتري سالمونلا+ تیمار با اکسیتتراسایکلین | ###02/0±22/0 | ###03/0±43/0 | ###04/0±66/0 | ||||
***: اختلاف آماری معنیدار با گروه شاهد سالم (001/0p<). **: اختلاف آماری معنیدار با گروه شاهد سالم (01/0p<). *: اختلاف آماری معنیدار با گروه شاهد سالم (05/0p<). ###: اختلاف آماری معنیدار با گروه شاهد بیمار (001/0p<). ##: اختلاف آماری معنیدار با گروه شاهد بیمار (01/0p<). #: اختلاف آماری معنیدار با گروه شاهد بیمار (05/0p<).
شکل 6- نمای ریزبینی از بافت کبد پرندگان گروه شاهد سالم که نشان میدهد، بافت کبد کاملاً سالم و طبیعی است
(رنگآمیزی هماتوکسیلین-ائوزین، درشتنمایی ×120).
شکل 7- نمای ریزبینی از بافت کبد جوجههای گروه شاهد گاواژ که در آن آسیب قابل ملاحظهای در بافت کبد مشاهده نمی‌شود
(رنگآمیزی هماتوکسیلین-ائوزین، درشتنمایی ×120).
شکل 8- نمای ریزبینی از بافت کبد جوجههای گروه مواجههیافته با باکتری سالمونلا. تغييرات شديد دژنراتیو و نکروز در نواحي مركز لوبولي كه تا نواحي پورتال نيز كشيده شده، ملاحظه میگردد. همچنین پرخونی شدید در وریدچه مرکزی و ورید پورتال و اتساع و پرخوني سينوزوئيدها نیز قابل مشاهده است (رنگآمیزی هماتوکسیلین-ائوزین، درشتنمایی ×120).
شکل 9- نمای ریزبینی از بافت کبد گروه مواجههیافته با باکتری سالمونلا بهعلاوه تیمار با عصاره آویشن. ملاحظه میگردد که از شدت پرخونی، تغییرات دژنراتیو و نکروز نسبت به بافت کبد گروه شاهد بیمار کاسته شدهاست (رنگآمیزی هماتوکسیلین-ائوزین، درشتنمایی ×120).
شکل 10- نمای ریزبینی از بافت کبد گروه مواجههیافته با باکتری سالمونلا بهعلاوه تیمار با آنتیبیوتیک اکسیتتراسایکلین. مشاهده میگردد که از وقوع صدمات بافتی ناشی از مواجهه تجربی با باکتری سالمونلا در کبد به خوبی جلوگیری شده و آسيب بافتي فقط در حد پرخونی جزئی و تغییرات دژنراتیو خفيف مشاهده میگردد (رنگآمیزی هماتوکسیلین-ائوزین، درشتنمایی ×120).
جدول 3- مقایسه شدت آسیب بافت کبد بین گروههای مورد مطالعه (مقادیر بهصورت ميانگين ± انحراف استاندارد در هر گروه ارائه شده است)
گروه مورد آزمايش | درجه آسيب در بافت کبد | ||
1) شاهد سالم | 0/0±0/0 | ||
2) شاهد گاواژ | 0/0±0/0 | ||
3) شاهد بیمار (مواجهه با باكتري سالمونلا) | ***56/0±12/3 | ||
4) مواجهه با باكتري سالمونلا+ تیمار با عصاره آویشن | **#08/0±99/1 | ||
5) مواجهه با باكتري سالمونلا+ تیمار با اکسی تتراسایکلین | ###3/0±45/0 | ||
***: اختلاف آماری معنیدار با گروه شاهد سالم (001/0p<). **: اختلاف آماری معنیدار با گروه شاهد سالم (01/0p<). *: اختلاف آماری معنیدار با گروه شاهد سالم (05/0p<).
###: اختلاف آماری معنیدار با گروه شاهد بیمار (001/0p<). ##: اختلاف آماری معنیدار با گروه شاهد بیمار (01/0p<). #: اختلاف آماری معنیدار با گروه شاهد بیمار (05/0p<).
بحث و نتيجهگيري
در تحقیق حاضر که به منظور ارزیابی تاثیر اسانس آویشن باغی در جلوگیری از عوارض عفونت تجربی ناشی از باکتری سالمونلا تایفیموریوم در روده و کبد جوجههای گوشتی انجام شد، بر اساس دادههای ارائه شده در جدول 1 که مربوط به نتایج بخش میکروبشناسي است، مشخص گرديد كه اسانس مذكور هر چند در جوجههای گوشتی گروه بیمار، از رشد باکتری فوق جلوگیری میکند ولی در مقام مقايسه، آنتيبيوتيك اکسیتتراسایکلین اثرات قویتری در کنترل میزان رشد باکتری سالمونلا تایفیموریوم دارد و اختلاف مشاهده هم از نظر آماری معنیدار میباشد (05/0p<)، البته ملاحظه میگردد که استفاده از اسانس آویشن باغی هم در کاهش رشد باکتری مذکور قابل توجه بود که این يافته با نتایج کارامان و همکاران همخوانی دارد (Karaman et al., 2001). با توجه به اینکه کارواکرول ترکیب اصلی و بیشترین جزء تشکیل دهنده اسانس آویشن باغي است (Nickavar et al., 2005; Mohammadpour-Vashvaei et al., 2015)، لذا احتمالاً اثرات مربوط به جلوگیری از رشد باکتری سالمونلا تا حد زیادی به علت میزان بالای کارواکرول موجود در اسانس این گیاه ميباشد. در اين ارتباط، کیم و همکاران در سال 1995 و بارت در سال 2004 هم اثرات ضد باکتریایی کارواکرول بر سالمونلا تایفیموریوم را در شرايط آزمايشگاهي مورد بررسی قرار داده و نشان داده بودند که کارواکرول اثرات قوی برعليه باکتری فوق دارد (Kim et al., 1995; Bart, 2004). نتایج تحقیقات مذکور هم با يافتههاي پژوهش حاضر که به ارزیابی تاثیر اسانس آویشن باغی در جلوگیری از عوارض عفونت تجربی ناشی از باکتری سالمونلا تایفیموریوم در روده و کبد جوجههای گوشتی پرداخته، همخوانی دارد. همچنين پالسن در سال 2001 و باگامبولا و همکاران در سال 2004 نيز اثرات ضدمیکروبی اسانس آویشن و ترکیبات کارواکرول و تیمول مربوط به آن را بر روی گونههاي باکتری شیگلا مورد مطالعه قرارداده و نتیجه گرفتهبودند که ترکیبات مذکور دارای اثرات باکتريكشي قوی بر روی باکتری‌های مذکور هستند (Paulsen, 2001; Bagamboula et al., 2004).
از طرف ديگر براساس نتایج آسيبشناسي تحقیق حاضر مشخص شد كه شدت آماس، زخم، خونریزی و نيز کاهش ارتفاع پرز مخاط روده باريك در جوجههاي گروه دريافت كننده اسانس آویشن باغي، کمتر از شدت و مقدار آن در روده پرندگان گروه بیمار تجربي بود كه این يافته هم نشاندهنده اثرات آویشن باغی در ممانعت از آسيب به بافت روده جوجههای گوشتی مواجهه يافته با باکتری بيماريزا و آسيبرسان سالمونلا تایفیموریوم بود. همچنين در کبد جوجههای گوشتی، ميزان و درجه آسیب بافتي در مورد پرندگان گروه تیمار شده با آویشنباغی بسيار کمتر از وضعيت موجود در كبد جوجههای گوشتی گروه بیمار تجربي بود. به همين‌شكل، حتي درجه آسیب در بافت كبد جوجههای گوشتی مربوط به گروه تیمارشده با آنتيبيوتيك اکسیتتراسایکلین بسیار کمتر از وضعيت موجود در كبد جوجههای گوشتی گروههاي تیمار شده با آویشن باغي و پرندگان گروه بیمار تجربي بود که این نتايج مهم نيز نشاندهنده اثرات قوی بهترتیب اکسیتتراسایکلین و اسانس آویشن باغی در جلوگیری از رشد باکتری سالمونلا تایفیموریوم و ممانعت و كاهش آسيب بافتي در كبد میباشد.
نتیجه نهائي اينكه براساس يافتههاي بخش ميكروبشناسي و آسيبشناسي تحقيق حاضر ميتوان ادعا كرد كه به احتمال زياد، اسانس گياه آویشن باغي در جلوگیری از رشد، ايجاد عفونت و آسيب بافتي ناشي از مواجهه تجربي با باکتری سالمونلاتایفیموریوم در جوجههای گوشتی نقش عمدهای دارد و بهنظر مي‌رسد كه استفاده از ترکیبات مكمل دارای آویشن باغي در تغذیه جوجههای گوشتی، میتواند در پيشگيري و حتي مهار و كنترل عفونتهاي سالمونلائي در گلههاي پرورشي طيور گوشتي، در كنار آنتيبيوتيكهاي رايج در فيلد بيماريهاي طيور موثر باشد.
سپاسگزاري
با توجه به اينكه، اطلاعات ارائه شده در تحقيق حاضر، برگرفته از يافتههاي پاياننامه دكتراي دامپزشكي نويسنده نفر اول با کد: 102200401664301400162498671 ميباشد. لذا نويسندگان مقاله بدينوسيله از كليه مسئولين دانشگاه آزاد اسلامي واحد علوم پزشكي تبريز، مخصوصا كارشناسان زحمتكش بخشهاي ميكروبشناسي و آسيبشناسي دانشكده دامپزشكي، كمال تشكر و قدرداني را دارند.
تضاد منافع
نويسندگان اعلام ميدارند كه هيچگونه تضاد منافع ندارند.
منابع
Amirmozaffari, N., Rahmani, Z. and Iesazadeh, K. (2013). Evaluation of the level of contamination with Salmonella spp. in red meat, chicken, and domestic and industrial eggs produced in Talesh city and assessment of their antibiotic resistance pattern. Medical Sciences Journal, 7(5): 60-65. [In Persian]
Antunes, P., Mourão, J., Campos, J. and Peixe, L. (2016). Salmonellosis: The role of poultry meat. Clinical Microbiology and Infection, 22(2): 110-121.
Azizpour, A. (2018). Survey on prevalence of Salmonella Enteritidis and Salmonella Typhimurium serotypes in broiler flocks of Ardabil province and determination of their antibiotics resistance to five antibacterial agents widely used in the Iranian medical field. Journal of Health, 9(2): 143-152. [In Persian]
Bart, S. (2004). Essential oils: their antibacterial properties and potential application in foods: a review. International Journal of Food Microbiology, 94(1): 223 -253.
Bagamboula. C.F., Uyttendaele, M. and Debevere, J. (2004). Inhibitory effect of thyme and basil essential oils, carvacrol, thymol, estragol, linalool and p-cymene towards Shigella sonnei and S.flexneri. Food Microbiology, 21(1): 32-42.
Esmaeili, H. and Hamedi, M. (2014). Salmonella’s serotypes in domestic eggs in Gilan province. Iran Journal Infectious Disease, 19(65): 39-45. [In Persian]
Fardous, J. and Shamsuzzaman, S. (2015). Detection of potential pathogenic aerobic bacteria from egg shell and egg contents of hen collected from poultry. Bangladesh Medical Research Council Bulletin, 41(2): 67-72.
Frei, A., Zimmermann, A. and Weigand, K. (1984). The N-terminal propeptide of collagen type III in serum reflects activity and degree of fibrosis in patients with chronic liver disease. Hepatology, 4(5): 830-834.
Ferrari, R.G., Rosario, D.K., Cunha-Neto, A., Mano, S.B., Figueiredo., E.E. and Conte-Junior, C.A. (2019). Worldwide epidemiology of Salmonella serovars in animal-based foods: a meta-analysis. Applied and environmental microbiology, 85(14): 59-69.
Gulgun, M., Erdem, O., Ozta, E., Kesik, V., Balamtekin, N., Vurucu, S., et al. (2010). Proanthocyanidin prevents methotrexate-induced intestinal damage and oxidative stress. Experimental Toxicology and Pathology, 62(2):109-115
Harsha, H., Reshmi, R., Varghese, R., Divya, P.S., Rahiman, K.M. and Hatha, A.M. (2011). Prevalence and antibiotic resistance of Salmonella from the eggs of commercial samples. Journal of Microbiology and Infectious Diseases, 1(03):93-100.
Mohammadpour-Vashvaei, R., Sepehri, Z., Jahantigh, M. and Javadian, F. (2015). Antimicrobial Activities of Teucrium polium against Salmonella Typhimurium. International Journal of Advanced Biological and Biomedical Research, 3(2): 149-152.
Tizfahm-Tikmedash, H., Nasiri-Semnani, S.H., Tajabadi-Ebrahimi, M., Alizadeh, H., Javadzadeh, Y. and Hamed Yazdan, S. (2013). Synergistic Antimicrobial Effect of Lactobacillus plantarum with Extracts of Satureia hortensis and Anethum geravolens on Salmonella Typhimurium; In Vitro and in Animal model. Journal of Ofogh-e-Danesh, 2(60): 90-95. [In Persian]
Jahantigh, M., Beigomi, M., Mohkami, Z. and Saeidi, S. (2022). Antimicrobial activity medical plant extracts, Prosopis farcta L. and Datura stramonium L., against Salmonella Typhimurium isolated from poultry in Zabol. Quality and Durability of Agricultural and Food stuffs, 1(3): 36-45. [In Persian]
Haji Seyedtaghiya, M., Nayeri Fasaei, B. and Peighambari, S.M. (2021). Antimicrobial and antibiofilm effects of Satureja hortensis essential oil against Escherichia coli and Salmonella isolated from poultry. Iranian journal of Microbiology, 13(1):74-80.
Jafari, R.A., Ghorbanpoor, M., Zahrae-Salehi, T., Mayahi, M. and Gholipour-Azar, M. (2017). Serotyping and antibiotic resistance patterns of isolated Salmonella from broiler chickens in Ahvaz. Journal of Veterinary Clinical Pathology, 4(4): 327-336. [In Persian]
Karaman, S., Digrak, M., Ravid, U. and IIcim, A. (2001). Antibacterial and antifungal activity of essential oils of Thymus revolutus celak from Turkey. Journal of Ethnopharmacology, 76(1): 183-186.
Kim, J.M., Marshall, M.R., Cornell, J.A., Preston, J.F. and Wel, C.I. (1995). Antibacterial activity of Carvacrol, Citral and Geraniol against Salmonella Typhimurium in culture medium and fish cube. Journal of Food Sciences, 60(1): 1364-1368.
Lee, G. and Luna, H.T. (1988). Manual of histologic staining methods of the armed forces institute of pathology. 3rd ed. The Blakiston Division Mc Graw. Hill Book Company, pp: 32-107.
Little, C., Walsh, S., Hucklesby, L., Surman-Lee, S., Pathak, K., Hall, Y., et al. (2006). Salmonella contamination in non-UK produced shell eggs on retail sale in some regions of England. Weekly releases (1997–2007), 11(47): 3081-3086.
Miranzadeh, H., Zahraei Salehi, T. and Karimi, V. (2012). The count of aerobic mesophill bacteria and isolate Salmonella spp. on egg in Isfahan. Veterinary Researches & Biological Products, 36(1):31-5. [In Persian]
Manandhar, B., Paudel, K.R., Sharma, B. and Karki, R. (2018). Phytochemical profile and pharmacological activity of Aegle marmelos Linn. Journal of Integrative Medicine, 16(3): 153-163.
Nickavar, B., Mojab, F. and Dolat-abadi R. (2005). Analysis of the essential oils of two Thymus species from Iran. Food Chemistry, 90(1): 609 - 611. [In Persian]
Paulsen, B.S. (2001). Plant polysaccharides with immunostimulatory activities. Current Organic Chemestry, 5(1): 939-950.
Rezaee, R., Mohammadi, S. and Faizee, S. (2018). A study of Salmonella spp. contamination of eggs in Sanandaj in 2017. Zanko Journal of Medical Sciences, 19(61): 43-49.
Villagran-de la Mora, Z., Vázquez-Paulino, O., Avalos, H., Ascencio, F., Nuno, K. and Villarruel-López, A. (2020). Effect of a synbiotic mix on lymphoid organs broilers infected with Salmonella Typhimurium and Clostridium perfringens. Animals (Basel), 10(886): 1-14.
