Investigating the effect of growth regulators on callusing and Somatic Embryogenesis of of Pekan variety walnut under in vitro conditions

Subject Areas : Sustainable production technologies

mohammad dali ¹ , mohammad motamedi ² , Shahab Sada ³

1 - 1- Graduated from the Department of Plant Production and Genetics, Ahvaz Branch, Islamic Azad University, Ahvaz, Iran.
2 - 2- Department of Plant Production and Genetics, Shoushtar Branch, Islamic Azad University, Shoushtar, Iran
3 - Plant Breeding Department, Islamic Azad University, Ahwaz, Iran

Received: 2024-03-01 Accepted : 2024-04-03 Published : 2024-06-19

Keywords: American walnut, embryogenesis, callus, tissue culture,

Abstract :

Walnut (Juglans regia L.) is a plant with a high economic value, and the use of micro propagation techniques will be very effective in the vegetative propagation of uniform superior cultivars and genotypes of walnut. In order to optimize walnut tissue culture, in this research, fresh branches of Pekan variety walnut trees were separated and transferred to the laboratory. For sterilization, callus formation and somatic embryogenesis, three experiments were performed with different treatments. Six sterilization treatments in a completely randomized design with 4 replications were considered for this research. In order to obtain callus, DKW culture medium was considered as the basic culture medium. 8 treatments of callus formation were investigated in a completely randomized design in 3 replications. In order to achieve indirect somatic embryogenesis, different combinations of TDZ and NAA were investigated in a completely randomized design in 4 replications. The results of analysis of variance of sterilization data indicated the existence of a significant difference between the mentioned treatments. The results of sterilization treatments showed 20% sodium hypochlorite for 5 minutes along with 70% alcohol for 15 seconds as the best result for sterilization of explants. DKW medium supplemented with 3 mg/L 2,4-D and 0.5 mg/L NAA gave the best result in callus formation. TDZ in the amount of 6 μM along with NAA in the amount of 0.2 μM had the best results in the embryogenesis of the resulting callus

References:

1. Abbasi, B., Saxena, P.K., Murch, S.J. and Liu, C.Z., 2007. Echinacea biotechnology: Challenges and opportunities. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Plant, 43: 481-492.
2. Bagheri, A., Saffari, M. 2009. In vitro culture of higher plants. Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran. p. 406.
3. Beyramizadeh E., Arminian A., Fazeli. 2020. Impact of growth regulators on callus formation and regeneration of ornamental plant zamiifolia. Journal of Cell & Tissue. 11(3). Pages 221-232. https://doi.org/10.52547/JCT.11.3.221
4. Ehtesham Nia, A. and Gholami, M. 2017. Investigating phenolic compounds leached from single-node walnut cuttings in DKW liquid culture medium. Technology of plant products, volume 18, number one. pp. 13-31.
5. FAO. 2014. FAOSTAT database results. http://faostat3.Fao.org.faostat.
6. Fernandez H, Perez C, Sanchez-Tames R. 2000. Modulation of the morphogenic potential of the embryonic axis of Juglans regia by cultural conditions. Plant Growth Regul. 30: 125-131.
7. George EF. Hall MA. De Klerk G. 2008. Plant propagation by tissue culture- 3rd Ed. The Background. 504.
8. Haj Hosni, N., Hosseini Moghadam, H. Hossein Sabouri, H. and Zarei. M. 2018. Investigating the effect of the type of culture medium on walnut processing in glass culture. The first national conference on novel ideas in agriculture and natural resources. Page 534. (In Farsi)
9. Hosseini-Nasr, M. and Rashid, A., 2002. Thidiazuron induced shoot-bud formation on root segments of Albizzia julibrissin is an apex-controlled, light independent and calcium-mediated response. Plant Growth Regulation, 36: 81–85.
10. Imam M. 2004. Asexual regeneration of mature Juglans regia by shoot tip culture. Pajouhesh and Sazandegi. 63:10-15.
11. Kaur, R., N, Sharma. K. Kumar., D. R. Sharma., and S. D. Sharma., 2006. Germination of walnut (Juglans regia L.) embryos. Scientia Horticulturae. 109, 385 388.
12. Mahmoud, I., Razzaq, A., Khan, Z.U.D., Hafez, I.A. and Kaleem, S., 2012. Evaluation of tissue culture responses of promising Wheat (Triticum aestivum L.) cultivars and development of efficient regeneration system. Pakistan Journal of Botany, 44:277-284.
13. Mirjani, L. and M. Emam. 2021. Effective factors of growth regulators on micropropagation of medicinal plant of (Myrtus communis L.). Iranian Journal of Rangelands and Forests Plant Breeding and Genetic Research, Vol. 29, No.1. Pages 138-147.
14. Mostafavi. A. 2008. Walnut proliferation under in vitro conditions in embryo culture, 6th Horticultural Science Congress.
15. Nejati Saravi, N. Babaian Jolodar, n. Bagheri, N. Pakdin Parisi, A. 2018. Investigating the effect of explant and different levels of NAA and 2-4-D hormones to induce callus in GLYCINE MAX soybean plant. The 6th National Conference of Medicinal Plants of Traditional Medicine and Organic Agriculture
16. Neuman MC, Preece JE, Van Sambeek JW, Gaffney GR. 1993. Somatic embryogenesis and callus production from cotyledon explants of Eastern black walnut. Plant Cell Tissue Organ Culture, 32: 9-18.
17. Payghamzadeh K., and Kazemitabar S.K. 2011. The effect of two types of culture medium, gibberellic acid and several physical factors on the germination of embryosis Iranian walnut (Juglans regia L). Journal of Horticultural Science. Vol. 25, No. 1, P. 45-54
18. Payghamzadeh K., and Kazemitabar S.K. 2010a. The effects of BAP and IBA and genotypes on in vitro germination of immature walnut embryos. International Journal of Plant Production. 4 (4), Pp: 309-322.
19. Sadata YA, Hennerty MJ. 2002. Factors affecting the shoot multiplication of Persian walnut (Juglans regia L.). Sci. Horticult. 95:251-260.
20. SAS Institute. 1997. SAS/STAT user’s guid. Version, 6.12., SAS Inst. Cary. NC.
21. Statistics of the Ministry of Agricultural-Jahad of Iran. 2020.
22. Steger, M.M., Preece, L.E., Hammerschlag, F., Saxena, P. 2003. The influence of source tree on somatic embryogenesis from eastern black walnut (Juglans nigra) immature cotyledons. Acta Hortic. 625:249-252.
23. Tehami, S.K. Ochi Ardabili, M. Farrokhi, J. 2015. Investigating the effect of plant growth regulators on callus formation of walnut (juglans Regia L.) in vitro conditions. The third scientific research congress of development and promotion of agricultural sciences, natural resources and environment of Iran
24. Yari, M. B., Gholami, M. and Ezniashri, M. 2011. The effect of sampling time, type and arrangement of explant culture and type of antioxidant on the establishment and growth of Iranian walnut explants in vitro. Journal of Horticultural Sciences of Iran, 42 (2) 141-149.
25. zaker Bostan Abad S, Bakhshi Khaniki G, Mohsennejad F. Asexual Reproduction of Juglans regia L. by using Growth Regulators of IBA and 2,4-D. NCMBJ. 2012; 2 (5):45-51.

Full-Text:



پژوهش‏های علوم کشاورزی پایدار/جلد 4/شماره 1/ 1403/ ص 37-25

https://www.sarj.iauk.ac.ir

 

بررسی اثر تنظیم¬کننده¬های رشد بر کالوس¬زایی و جنین زایی رویشی گردو رقم پکان (Carya illinoensis) در شرایط درون شیشه¬ای

 

محمد دلی1، محمد معتمدی*2 و شهاب سادات جعفری3

1-دانش آموخته گروه تولید و ژنتیک گیاهی، واحد اهواز، دانشگاه آزاد اسلامی، اهواز، ایران

2-استادیار گروه تولید و ژنتیک گیاهی، واحد شوشتر، دانشگاه آزاد اسلامی، شوشتر، ایران

3-استادیار گروه تولید و ژنتیک گیاهی، واحد اهواز، دانشگاه آزاد اسلامی، اهواز، ایران

* ايميل نویسنده مسئول: [e-mail]

(تاریخ دریافت: 11/12/1402- تاريخ پذيرش:15/1/1403)

 

چکیده

گردوی پکان (Carya illinoensis) گیاهی با ارزش اقتصادی بالا است. استفاده از تکنیک های ریزازدیادی در تکثیر رویشی ارقام و ژنوتیپ¬های برتر یکنواخت گردو بسیار موثر خواهد بود. به منظور بهینه¬سازی کشت بافت گردو، در این پژوهش سرشاخه¬های تازه درخت گردو رقم پکان جداسازی و به آزمایشگاه انتقال یافتند. جهت سترون-سازی، کالوس¬زایی و جنین¬زایی بدنی سه آزمایش با اعمال تیمارهای مختلف انجام شد. شش تیمار سترون سازی در یک طرح کاملا تصادفی با 4 تکرار برای این تحقیق در نظر گرفته شد. جهت دستیابی به کالوس محیط کشت DKW به عنوان محیط کشت پایه در نظر گرفته شد. 8 تیمار کالوس¬زایی در یک آزمایش فاکتوریل در قالب طرح کاملا تصادفی در 4 تکرار مورد بررسی قرار گرفتند. جهت دستیابی به جنین¬زایی سوماتیکی غیر مستقیم، ترکیبات متفاوتی از TDZو نیز NAA در یک آزمایش فاکتوریل در قالب طرح کاملا تصادفی در چهار تکرار مورد بررسی قرار گرفت. نتایج حاصل از تجزیه واریانس داده¬های سترون¬سازی دال بر وجود اختلاف معنی¬دار بین تیمارهای مذکور بود. نتایج اعمال تیمارهای سترون¬سازی، هیپوکلریت سدیم 20% به مدت 5 دقیقه همراه با الکل 70% به مدت 15 ثانیه را به عنوان بهترین نتیجه برای سترون سازی ریزنمونه¬ها معرفی نمود. محیط کشت DKW که با 3 میلی گرم در لیتر 2,4-D و 5/0 میلی گرم در لیتر NAA تکمیل شده بود بهترین نتیجه را در کالوس زایی به همراه داشت. TDZ در مقدار 6 میکرومولار به همراه NAA میزان2/0 میکرومولار بهترین نتیجه را در جنین¬زایی کالوس¬های حاصل به همراه داشتند.  

واژه‏هاي کليدي: گردوی آمریکایی، جنین زایی، کالوس، کشت بافت

 

 

مقدمه

گردوهایی که در نقاط گردو خیز ایران کاشته شده‌اند از گونه گردوی معمولی یا Juglans هستند. پکان یا "گردوی آمریکایی" با نام علمی Carya illinoensis  به خانواده Juglandaceae  تعلق داشته و بومی آمریکای مرکزی می­باشد و از بهترین انواع گردو برای مناطق گرمسیری است که در مناطق گرم و با رطوبت بالا رشد می­کند. در برخی از ارقام پکان، میزان اسید اولئیک بیش از دو برابر گردوی معمولی بوده و به بیش از ۷۵ درصد می­رسد. ایران پس از چین و آمریکا رتبه سوم سطح زیر کشت و تولید گردو را در جهان داراست (FAOSTAT, 2014). میزان تولید گردو در کشور بالغ بر 265 هزار تن و سطح زیر کشت 170 هزار هکتار می­باشد (آمارنامه وزارت جهاد کشاورزی، 1399).

علی­رغم اهمیت اقتصادی گردو، متاسفانه روشهای مطلوب تکثیر توسعه نیافته­اند و محصول گردو در کشور غیریکنواخت می­باشد که این امر از دلایل سهم کمتر در صادرات این محصول است. گردو گیاهی سخت ریشه زا است و تکثیر واریته­های مختلف آن از طریق روشهای متداول غیرجنسی مشکل است. ازدیاد به روش جنسی با مشکلاتی نظیر تفرق صفات، حصول تعداد کم گیاه سالم و همچنین تنوع بالای نتاج مواجه است. در روشهای معمول تکثیر رویشی نیز بیماریهای میکروبی به راحتی می­توانند از نسلی به نسل دیگر منتقل شوند، بنابراین استفاده از روشهای کشت بافت و ریزازدیادی برای تولید انبوه واریته­های سالم و نیز با بنیه بالای گردو که از لحاظ مورفولوژیک و ژنتیکی یکنواخت باشند ضروری می­باشد (Bagheri et al., 2009).

کشت بافت گياهي نقش اساسي در بهبود ژنتيکي گياهاني دارد که به روش غيرجنسي تکثير مي يابند. جنین زایی از تکنیک­های ریزازدیادی است که کشت یکنواخت و حذف مشکلات ریشه­زایی توسط تولید ریشه و ساقه از جنین را ممکن می­سازد (Tahami et al., 2016). 

در میان محیط­های کشت پایه برای گیاه گردو محیط کشت MS ساده و نیز DKW متداول­ترین محیط­های کشت می­باشند. گردوی ایرانی نیاز به محیط کشت غذایی با نمک­های بالا دارد و محیط کشت DKW از این لحاظ مناسب است. این محیط کشت در میزان نیتروژن شبیه محیط کشت MS بوده ولی در بعضی از اجزا از محیط کشتMS  قوی­تر است (Sadata & Hennerty 2002; Payghamzade & Kazemi Tabar, 2010).  

تحقیقاتی در خصوص ریزازدیادی گردوی ایرانی انجام شده است. کالوس زایی، تمایز و ریزازدیادی گردوی ایرانی (Juglans regia L.) را مورد بررسی قرار دادند و بیان نمودند که در محیط کشت WPM همراه با کاربرد هورمون ایندول-3-بوتیریک اسید (IBA) باززایی ریشه 70 و باززایی یا تمایز ساقه 60 درصد و بدون استفاده از هورمون کمتر از 50 درصد برای ریشه و ساقه بود و نتایج این تحقیق مشخص کرد که استفاده از هورمون IBA جهت بهبود ریزازدیادی جنین گردو مناسب می­باشد (Mostafavi et al., 2009).

در بررسی تأثیر نوع محیط کشت بر پرآوری گردو در کشت درون شیشه­ای برای تولید کالوس از محیط MS با غلظت های 3 ، 6 و 9 میلی­گرم در لیتر  BAP به همراه 4 میلی­گرم در لیتر IBAاستفاده شد که بیشترین میزان کالوس­زایی مربوط به6 میلی گرم در لیتر BAP همراه با 4 میلی­گرم در لیتر IBA  بود (Hajhasani et al., 2018).

محققان در ارتباط با جنین­زایی و بدست آوردن کالوس از گیاه گردو تفاوت معنی دار سطوح مختلف BA و NAA را گزارش کردند. در محیط کشت DKW حاوی 2/5 میلی گرم بر لیتر به همراه یک میلی­گرم بر لیتر BA و محیط کشت DKW حاوی 2/5 میلی­گرم بر لیتر به تنهایی و در محیط کشت DKW حاوی 1 میلی­گرم بر لیتر به همراه یک میلی­گرم بر لیتر NAA بهترین ترکیب تیماری برای کالوس­زایی بود (Tahami et al., 2016). در تحقیقی با بررسی ریشه­زایی گردوی محلی کاغذی نشان دادند که تیمار IBA در روش قلمه­زني نقش موثري در ظهور اولين پريمورديوم ريشه داشت، ولی تیمار 2,4-D روي ظهور اولين پريمورديوم ريشه، تاثير چنداني از خود نشان نداد. همچنين تیمارهای 2,4-D و IBA هر دو موجب افزايش طول ريشه چه و افزايش درصد بقاي قلمه­هاي ريشه­دار شده گردیدند(Zaker Bostan Abad et al., 2012) .

  در بررسی تأثیر محیط کشت و تنظیم­کننده­های رشد بر ريزازديادی گیاه دارويي Myrtus communis L. محیط کشت DKW را محرک تولید بیشترین ریشه اصلی و فرعی دانستند که امکان دستیابی به مناسبترین روش ریزازدیادی را فراهم می­سازد (Mirjani & Emam, 2021). بررسی تاثیر ریزنمونه و سطوح مختلف هورمون­های NAA و 2,4_D جهت القای کالوس در گیاه سویا نشان دادند که بیشترین درصد کالوس­زایی در کمترین زمان ممکن مربوط به محیط کشت حاوی 4 میلی گرم در لیتر هورمون NAA و 4 میلی گرم در لیتر هورمون2,4_D  بوده است (Nejati Saravi et al., 2018). در پژوهشی ترکیبی از سه هورمون BA، Kin و نیز GA3 را برای جنین­زایی در گردو پیشنهاد داده اند (Kaur et al., 2006). در بررسی دو ژنوتیپ گردو ( Z60 و Z63 ) روی محیط کشت پرآوری (DKW دارای 0/6 میلی­گرم در لیترهورمون BA ) که دارای 6-5 سانتی متر طول بودند از دو محیط کشت پایه MS و DKW هر کدام با 4/1 غلظت عناصر برای ریشه­زایی استفاده شد. این محیط­ها همراه با هورمون NAA در چهار غلظت ( 1 و 2 و 3 و 4 ) میلی­گرم در لیتر همراه با شاهد برای مرحله القای ریشه مورد بررسی قرار گرفت. در محیط DKW با افزایش غلظت میزان ریشه­زایی 6 برابر افزایش یافت. حداقل میزان صفات مورد بررسی نیز به تیمار بدون هورمون MS مربوط است که در وزن تر ریشه تفاوت معنی­داری با DKW ندارد(Yari et al., 2011) .

با توجه به کاربرد­های وسیع و نیز اهمیت دستیابی به کالوس و جنین­های رویشی در اصلاح گیاه گردو گونه پکان، این تحقیق با هدف دستیابی به دستورالعمل­های کالوس­زایی و نیز جنین­زایی رویشی این گونه درختی با ترکیب مناسبی از تنظیم کننده­های رشد گیاهی انجام گرفت.

 

مواد و روش‏ها

  در پژوهش حاضر سرشاخه­های تازه و ساقه­های حاوی گره گیاه گردو گرمسیری گونه درختی پکان جدا سازی و به آزمایشگاه دانشکده کشاورزی دانشگاه آزاد اسلامی واحد شوشتر انتقال یافتند. قطعات حاوی دمبرگ و نیز میانگره­ها به عنوان ریزنمونه در نظر گرفته شد. دستیابی به بافت کالوس از ساقه های حاوی گره و نیز دمبرگ­های جوان می­تواند به جدید بودن و نوآوری تحقیق بیافزاید.

 جهت دستيابي به مناسبترين روش ممكن براي سترون كردن نمونه ها در رقم مورد مطالعه پس از شستشوی ریزنمونه­ها با آب به مدت نیم ساعت و غوطه وری در الکل 70 درصد به مدت 15 ثانیه، شش تیمار هیپوکلریت سدیم 20% (در 6 بازه زمانی 1، 3، 5، 7، 9و11  دقیقه) در قالب یک طرح کاملا تصادفی در چهار تکرار استفاده شد. پس از طی مراحل ضد عفونی ریز نمونه­ها در محیط کشت DKW  (Driver & Kuniyuki, 1984)قرار گرفت و به اتاقک رشد (انکوباتور) در شرایط تاریکی با تهویه مناسب و دمای 25 درجه سانتیگراد منتقل شدند. برای القای کالوس‏زایی در محیط کشت DKW هشت تيمار کالوس­زايي با غلظت‏های مختلفی از اکسین ‏2,4-D و NAA در يک آزمایش فاکتوریل در قالب طرح کاملا تصادفي با چهار تکرار استفاده شد (جدول 1). فاکتور A هورمون 2,4-D با چهار غلظت (1، 2، 3 و 4 میلی­گرم در لیتر) و فاکتور B هورمون NAA در دو غلظت (5/0 و 1 میلی گرم در لیتر) استفاده شدند. نگهداری کالوس‏ها در شرایط تاریکی تا پایان هفته چهارم صورت گرفت. پس از چهار هفته از کشت، کالوس‏­های حاصل در محیط کشت جدید با همان ترکیب قبلی از هورمون‏های رشد کشت داده شدند. باززایی کالوس‏ها هر چهار هفته یکبار انجام شد. تشکیل ترکیبات پلی­فنولیک در گیاهان چوبی به کرات گزارش گردیده است و در گردو نیز در گزارشات متعدد به راهکارهای موثری پرداخته شده است که یکی از این راهکارها استفاده از زغال فعال است (Ehtesham Nia & Gholami, 2017). بدین منظور ابتدا ریزنمونه­ها به محیط­های کشت کالوس حاوی زغال فعال ( ساخت شرکت دایجونگ کره جنوبی) انتقال یافتند. پس از 4 هفته، ریزنمونه ها از محیط کشت زغال فعال مجددا به محیط های کشت کالوس­زایی ساده انتقال یافتند.

به منظور جنین­زایی سوماتیکی، ترکیبات متفاوتی از TDZ در سه سطح (2، 4 و 6 میکرومولار) و NAA در دو غلظت (2/0 و 5/0 میکرومولار) در یک آزمایش فاکتوریل در قالب طرح کاملا تصادفی در 4 تکرار مورد بررسی قرار گرفت (جدول 2). پس از انتقال ریزنمونه‏ها به واحدهای کشت، واحدهای کشت به اتاقک رشد با سیکل 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی با درجه حرارت ˚C 25 انتقال یافتند. جنین های بدست آمده جهت افزایش رشد و نمو به محیط کشت فاقد هورمون انتقال یافتند.

تمامی داده­ها با استفاده از نرم افزار آماری SAS (1/9) مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. مقایسه میانگین تیمارها به روش دانکن در سطح آماری 5 درصد انجام گردید. هیستوگرام­ها نیز با استفاده از نرم افزار اکسل (2013) بدست آمد.

 

 

 

 

جدول1- تیمارهای اعمال شده جهت القا کالوس زایی

شماره	تیمار
1	2,4-D به میزان 1 میلی­گرم و NAA به میزان 5/0 میلی­گرم در لیتر
2	2,4-D به میزان 1 میلی­گرم و NAA به میزان 1 میلی­گرم در لیتر
3	2,4-D به میزان 2 میلی­گرم و NAA به میزان 5/0 میلی­گرم در لیتر
4	2,4-D به میزان 2 میلی­گرم و NAA به میزان 1 میلی­گرم در لیتر
5	2,4-D به میزان 3 میلی­گرم و NAA به میزان 5/0 میلی­گرم در لیتر
6	2,4-D به میزان 3 میلی­گرم و NAA به میزان 1 میلی­گرم در لیتر
7	2,4-D به میزان 4 میلی­گرم و NAA به میزان 5/0 میلی­گرم در لیتر
8	2,4-D به میزان 4 میلی­گرم و NAA به میزان 1 میلی­گرم در لیتر

جدول 2- تیمارهای اعمال شده جهت القا جنین­زایی

شماره	تیمار
1	TDZ به میزان 2 میکرومولار و NAA به میزان 2/0 میکرومولار
2	TDZ به میزان 2 میکرومولار و NAA به میزان 5/0 میکرومولار
3	TDZ به میزان 4 میکرومولار و NAA به میزان 2/0 میکرومولار
4	TDZ به میزان 4 میکرومولار و NAA به میزان 5/0 میکرومولار
5	TDZ به میزان 6 میکرومولار و NAA به میزان 2/0 میکرومولار
6	TDZ به میزان 6 میکرومولار و NAA به میزان 5/0 میکرومولار

 

 

نتایج و بحث

نتايج تجزيه واريانس داده هاي حاصل از اعمال تيمارهاي مختلف سترون سازي (جدول3) ریزنمونه های گردو رقم پکان نشان دهنده اختلاف معني دار اين تيمارها در سطح آماری 5 درصد بود. 

نتايج حاصل از مقايسه ميانگين دانکن (شکل 1) نيز نشان مي­دهد که تیمار غوطه وری در الکل 70 درصد به مدت 15 ثانیه و نیز استفاده از هيپوکلريت سديم 20 درصد  به مدت 5 دقيقه  با میانگین 9 ریزنمونه سترون و سالم بهترین نتیجه را در سترون سازی ریزنمونه­ها به همراه داشته است و با بقيه تيمارها اختلاف معني داري دارد. گزارشات متعددی در استفاده از هیپوکلریت سدیم به تنهایی و یا در ترکیب با الکل 70% جهت سترون سازی انواع ریزنمونه های تهیه شده در گیاه گردو وجود دارد. در تحقیقی جهت سترون­سازي سرشاخه­های انتهایی گردوی ایرانی مناسب­ترین روش را غوطه ور کردن جوانه­ها در محلول اتانل 70 درصد به مدت يک دقيقه و بعد استفاده از محلول کلرورمرکوريک 1/0 درصد به مدت 1.5 دقيقه عنوان کرد (Imam, 2004).

 

 

 

 

 

 

جدول3- نتايج تجزيه واريانس تيمارهاي مختلف سترون سازي در گردو رقم پکان

منبع تغییرات	درجه آزادی	میانگین مربعات
تیمار سترون سازی	5	*54/44
خطا	18	347/0
کل	23	95/9

 

 

شکل1- مقایسه میانگین تيمارهاي سترون سازي، ميانگين تعداد ريزنمونه هاي سالم و سترون در هر تيمار در گردو رقم پکان. (میانگین­های دارای حروف مشترک تفاوت آماری معنی­داری در سطح 5 درصد نداشنه و در یگ گروه قرار می­گیرند)

 

 

کالوس­زایی

از آنجایی که کالوس به عنوان ماده اولیه براي کشت­هاي سلولی و تولید متابولیت­هاي ثانویه و نیز تولید گیاه­چه به روش غیرمستقیم ضروري می­باشد، لذا غلظت معینی از تنظیم کننده­هاي رشد جهت تولید کالوس، تأثیر ديکلروفنوکسی استیک اسید (2,4-D) و نفالین استیک اسید (NAA) بر میزان تولید کالوس رقم پکان گردو در شرایط درون شیشه­اي مورد بررسی قرار گرفت. نتايج حاصل از تجزيه واريانس تيمارهاي مختلف کالوس­زايي(جدول4) نيز نشان داد که بين تیمارها اختلاف معني­داري در سطح 01/0= α وجود دارد. همچنين اثر متقابل دو هورمون مورد استفاده (جدول 1) بر تعداد کالوس­های توليد شده در سطح احتمال یك درصد اثر معني­دار داشتند این بدان مفهوم است که فاکتورهای مورد مطالعه از نظر تأثير بر صفت مورد مطالعه به صورت مستقل از یکدیگر عمل نمي­کنند و وابسته به یکدیگر مي­باشند. مقایسه میانگین اثر متقابل (شکل2) دو هورمون 2-4-D و NAA بر کالوس­زایی رقم پکان گردو نشان داد بیشترین تعداد کالوس­زایی در تيمار 5 (2,4-D به میزان 3 میلی­گرم و NAA به میزان 5/0 میلی­گرم در لیتر) با ميانگين 5/9 کالوس از 10 ريزنمونه (95 درصد)، به دست آمده است. ميزان توليد کالوس بستگي به ترکيب هورمون­های به کار رفته در محيط کشت دارد و تعادل بين هورمون­های اکسين و سيتوکنين یك فاکتور مورفولوژیکي تعيين کننده  و مهم به شمار ميرود (Abbasi et al. 2007) البته بين اثرات متقابل هورمون­های 2, 4-D و NAA در کالوس زایي اثر متقابل افزایشي وجود نداشت، به طوریکه در بالاترین غلظت هورمونها بيشترین درصد کالوس­زایي در ریزنمونه­های رقم پکان مشاهده نشد در حالی که (Kaur et al., 2006) گزارش كردند كه در غلظت كم اكسين ريشه­هاي نابه جا حالت غالب دارد و اندام­زايي را تحريك مي­كند ولی در غلظت زیاد اکسین تشکیل ریشه صورت نمی­گیرد و تشکیل کالوس اتفاق می­افتد. نقش اکسين­ها و اثرات متقابل بين آنها در فرایندهای مورفوژنز در طي تمایز اندامها به خوبي اثبات شده است (Hosseini-Nasr & Rashid, 2002). با این حال در تحقیقی دیگر گزارش شد که غلظت­های خيلي زیاد هورمون D-2,4 ممکن است برای بيان ژن­های درگير در تقسيم سلولي و تمایززدایي بافته مهارکننده باشد که با نتایج این آزمایش نیز مطابقت دارد به طوری که کمترین میزان کالوس­زایی در بالاترین غلظت 2,4-D به دست آمد که متعلق به تیمار شماره 8 (2,4-D به میزان 4 میلی­گرم و NAA به میزان 1 میلی­گرم در لیتر) بود و البته با تیمار شماره 7 (2,4-D به میزان 4 میلی­گرم و NAA به میزان 5/0 میلی­گرم در لیتر) نیز اختلاف معنی­داری نداشت (Mahmoud et al., 2012). در تحقیقی نیز عنوان نمودند با افزایش میزان اکسین از یک به 2 میلی­گرم در لیتر برای 2, 4-D، درصد و حجم کالوس­زایی نیز کاهش معنی­داری داشت که این نتیجه را به سمیت یا اثرات منفی کالوس به مقادیر زیادتر اکسین نسبت دادند (Beyramizade et al., 2020). (Peyghamzedeh et al. 2011) همچنین در گزارشی دو هورمون IBA در غلظت­های 01/0 تا 1/0 و نیز BAP در غلظت 5/1 میلی­گرم در لیتر بصورت ترکیبی می­توانند موجب تشکیل کالوس از جنین­های نابالغ گردند. در این پژوهش به دو دلیل از ترکیبات هورمونی توصیه شده توسط این محققین استفاده نگردید. دلیل اول آنکه ترکیبات توصیه شده توسط این محققین برای کشت جنین نابالغ بوده که از نظر میزان هورمون­های درون­زا کاملا متفاوت با سرشاخه و نیز بخش­های حاوی گره می­باشد. معرفی یک پروتوکول برای یک گونه گیاهی و بر روی یک نوع ریزنمونه خاص به معنای موثر بودن آن برای سایر گونه­ها و یا سایر بافت­ها و یا اندام­هایی نمی­باشد. دوم آنکه مقایسه دو هورمون اکسین متداول و ارزان قیمت شامل 2,4-D و نیز نفتالن استیک اسید (NAA) در مقایسه با دو هورمون گران قیمت ایندول بوتیریک اسید (IBA) و نیز بنزیل آمینوپورین (BA) باعث می­شود که در برنامه­های تجاری جنین­زایی غیرمستقیم که از طریق بافت کالوس حاصل می­شود، محققین در برنامه کالوس­زایی به استفاده از هورمون­های ارزان قیمت توجه بیشتری نشان دهند.

 

 

 

 

 

 

 

جدول4- نتايج تجزيه واريانس تيمارهاي مختلف کالوس زايي، در گردو رقم پکان

منبع تغییرات	درجه آزادی	میانگین مربعات
تیمار کالوس سازی	7	**1/19
عامل A (2,4-D)	3	**69/19
عامل B (NAA)	1	**53/2
AB	3	**03/24
خطا	24	26/0
کل	31	51/4

 

 

شکل2- مقایسه میانگین تيمارهاي مختلف كالوس­زايي (جدول 1) بر ميانگين تعداد ريزنمونه­هاي کالوس­زا به روش دانكن(05/0=α )در گردو رقم پکان. ميانگين تيمارهایي که دارای حروف یکسان مي­باشند بر اساس آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد تفاوت معني­داری با هم ندارند.

 

جنین­زایی

نتايج حاصل از تجزيه واريانس تيمارهاي مختلف جنین زایی(جدول 5) نيز نشان داد که بين تیمارها اختلاف معني­داري در سطح 01/0= α وجود دارد. نتايج آزمون دانكن نيز (شکل3) نشان دهنده اين بود كه تيمار شماره 5 شامل TDZ به میزان 6 میکرومولار و NAA به میزان 2/0 میکرومولار به عنوان بهترین تیمار جنین­زایی رویشی بیشترین تاثیر را در جنین­زایی به همراه داشته است. این تیمار دارای میانگین 9 کالوس جنین­زا بود. محققینی نیز از TDZ در کنار هورمون 2,4-D برای جنین­زایی گردو استفاده نمودند (Neuman et al., 1992; Steager et al., 2003). هر دو گزارش مقدار 5 میکرومولار TDZ را برای جنین­زایی پیشنهاد نموده­اند که به نتایج این تحقیق در مقدار استفاده شده از TDZ بسیار نزدیک است لکن در نوع اکسین بکار رفته مطابقتی با نتایج این تحقیق وجود ندارد. در این مطالعه، اکسین NAA مورد استفاده قرار گرفته است. در جنین­ز­ایی گردو از NAA به میزان 1/0 تا 5/0 میلی­گرم در لیتر استفاده نموده اند. علت افت جنین­زایی در تیمار ششم می­تواند به افزایش غلظت هورمون­های رشد خصوصا اکسین مربوط باشد (Fernandez et al., 2000). همچنین گزارش شده که در اکثر اثرات اکسین، یک منحنی با فعالیت زنگوله­ای شکل از غلظت استفاده شده می­تواند مشاهده گردد. آنها پیشنهاد دادند که در غلظت­های بالا، اکسین معمولا حالت باز دارنده رشد جنین­زایی دارد (George et al., 2008). این اثر باز دارنده معمولا به علت افزایش تولید اتیلن در غلظت­های بالای اکسین است. در هر حال نتایج این مطالعه برای اکسینNAA نشان داد که غلظت بالای 5/0 میکرو مولار می­تواند اثر باز دارنده داشته و منجر به کاهش تولید جنین­های سوماتیکی گردد. این نکته نباید فراموش گردد که غلظت اشاره شده می­تواند از اکسینی به اکسین دیگر، از گیاهی به گیاه دیگر و از مرحله ی نموی تا مرحله نموی دیگر متفاوت باشد.

جنین­های بدنی که به مراحل پیشرفته نمو می­رسیدند، شروع به سنتز کلروفیل تحت شرایط نوری نمودند. به محض اینکه پروسه­ی بلوغ و رسیدگی جنین اتفاق می­افتد و کامل می­شود، جنین­های سوماتیکی رنگدانه­های سبز رنگ نرمال را بدست می آورند. کالوس­های جنین­زا ترد، محتوی سلولهای گلوبولار شیری رنگ کوچک و کشیده بوده که در واقع از آنها جنین­ها شکل گرفتند.

 

جدول5- نتايج تجزيه واريانس تيمارهاي مختلف جنین­زایی در گردو رقم پکان

منبع تغییرات	درجه آزادی	میانگین مربعات
تیمار جنین سازی	5	**94/23
عامل A	2	**16/6
عامل B	1	**04/70
AB	2	**66/18
خطا	18	23/0
کل تصحیح شده	23	38/5

 

 

 

شکل 3- تيمارهاي جنین­زایی، ميانگين تعداد کالوس­هاي جنین­زا براي هر تيمار و اختلافات بين تيمارها از طريق آزمون دانكن (05/0= (αدر گردو رقم پکان. ميانگين تيمارهایي که دارای حروف یکسان مي­باشند بر اساس آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد تفاوت معني­داری با هم ندارند.

 

 

 

 

نتیجه­گیری

جنین­های سوماتیکی یکی از کاربردی ترین دستاوردهای تکنولوژی کشت بافت گیاهی است. جنین زایی سوماتیکی دارای پتانسیل بسیار بالایی برای حفاظت از ژرم­پلاسم، ترانسفورماسیون و نیز تولید بذر مصنوعی در برنامه های به نژادی هستند. از سویی دیگر هزینه­های ناشی از تکثیر انبوه گیاهان با ارزش اقتصادی بالا هنوز هم در مقایسه با روش­های معمول بالاست. به نظر می­رسد با بهره گیری از تکنولوژی جنین­زایی بدنی می­توان میزان تکثیر کلون را به میزان چندین برابر نسبت به روش ریزازدیادی افزایش داد و لذا هزینه­های تکثیر انواع گونه­های گیاهی با ارزش نظیر گردو را به روش کشت بافت تقلیل یابد. نتایج حاصل از این تحقیق جهت پیشنهاد دستورالعمل­های کالوس­زایی و نیز جنین زایی در گردوی گرمسیری رقم پکان نشان داد که محیط کشت DKW که با 3 میلی­گرم در لیتر 2,4-D و 5/0 میلی­گرم در لیتر  NAA تکمیل شده بود بهترین نتیجه را در کالوس­زایی به همراه داشت. TDZ در مقدار 6 میکرومولار به همراه NAA میزان2/0 میکرومولار بهترین نتیجه را در جنین­زایی کالوس­های حاصل به همراه داشتند. از آنجایی که ژنوتیپ­ها و حتی اکوتیپ­های مختلف از نظر میزان هورمون­های درون­زا متفاوتند، توصیه می­گردد تا برای سایر گونه­های گردو و یا اکوتیپ­های مناطق دیگر، کارآمدی پروتوکول­های معرفی شده پیش از شروع یک برنامه اصلاحی مورد آزمایش قرار گیرند. همچنین نوع بافت انتخاب شده در این تحقیق می­تواند بر نوع و غلظت هورمونهای درون زا تاثیر گذار باشد.

 

 

 

REFRENCES

 

Abbasi, B., Saxena, P.K., Murch, S.J. and Liu, C.Z., 2007. Echinacea biotechnology: Challenges and opportunities. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Plant, 43: 481-492.

Bagheri, A., Saffari, M. 2009. In vitro culture of higher plants. Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran. p. 406.

Beyramizadeh E., Arminian A., Fazeli. 2020. Impact of growth regulators on callus formation and regeneration of ornamental plant zamiifolia. Journal of Cell & Tissue. 11(3). Pages 221-232. https://doi.org/10.52547/JCT.11.3.221

Ehtesham Nia, A. and Gholami, M. 2017. Investigating phenolic compounds leached from single-node walnut cuttings in DKW liquid culture medium. Technology of plant products, volume 18, number one. pp. 13-31.

FAO. 2014. FAOSTAT database results. http://faostat3.Fao.org.faostat.

Fernandez H, Perez C, Sanchez-Tames R. 2000. Modulation of the morphogenic potential of the embryonic axis of Juglans regia by cultural conditions. Plant Growth Regul. 30: 125-131.

George EF. Hall MA. De Klerk G. 2008. Plant propagation by tissue culture- 3rd Ed. The Background. 504.

Haj Hosni, N., Hosseini Moghadam, H. Hossein Sabouri, H. and Zarei. M. 2018. Investigating the effect of the type of culture medium on walnut processing in glass culture. The first national conference on novel ideas in agriculture and natural resources. Page 534. (In Farsi)

Hosseini-Nasr, M. and Rashid, A., 2002. Thidiazuron induced shoot-bud formation on root segments of Albizzia julibrissin is an apex-controlled, light independent and calcium-mediated response. Plant Growth Regulation, 36: 81–85.

Imam M. 2004. Asexual regeneration of mature Juglans regia by shoot tip culture. Pajouhesh and Sazandegi. 63:10-15.

Kaur, R., N, Sharma. K. Kumar., D. R. Sharma., and S. D. Sharma., 2006. Germination of walnut (Juglans regia L.) embryos. Scientia Horticulturae. 109, 385 388.

Mahmoud, I., Razzaq, A., Khan, Z.U.D., Hafez, I.A. and Kaleem, S., 2012. Evaluation of tissue culture responses of promising Wheat (Triticum aestivum L.) cultivars and development of efficient regeneration system. Pakistan Journal of Botany, 44:277-284.

Mirjani, L. and M. Emam. 2021. Effective factors of growth regulators on micropropagation of medicinal plant of (Myrtus communis L.). Iranian Journal of Rangelands and Forests Plant Breeding and Genetic Research, Vol. 29, No.1. Pages 138-147.

Mostafavi. A. 2008. Walnut proliferation under in vitro conditions in embryo culture, 6th Horticultural Science Congress.

Nejati Saravi, N. Babaian Jolodar, n. Bagheri, N. Pakdin Parisi, A. 2018. Investigating the effect of explant and different levels of NAA and 2-4-D hormones to induce callus in GLYCINE MAX soybean plant. The 6th National Conference of Medicinal Plants of Traditional Medicine and Organic Agriculture

Neuman MC, Preece JE, Van Sambeek JW, Gaffney GR. 1993. Somatic embryogenesis and callus production from cotyledon explants of Eastern black walnut. Plant Cell Tissue Organ Culture, 32: 9-18.

Payghamzadeh K., and Kazemitabar S.K. 2011. The effect of two types of culture medium, gibberellic acid and several physical factors on the germination of embryosis Iranian walnut (Juglans regia L). Journal of Horticultural Science. Vol. 25, No. 1, P. 45-54

Payghamzadeh K., and Kazemitabar S.K. 2010a. The effects of BAP and IBA and genotypes on in vitro germination of immature walnut embryos. International Journal of Plant Production. 4 (4), Pp: 309-322.

Sadata YA, Hennerty MJ. 2002. Factors affecting the shoot multiplication of Persian walnut (Juglans regia L.). Sci. Horticult. 95:251-260.

SAS Institute. 1997. SAS/STAT user’s guid. Version, 6.12., SAS Inst. Cary. NC.

Statistics of the Ministry of Agricultural-Jahad of Iran. 2020.

Steger, M.M., Preece, L.E., Hammerschlag, F., Saxena, P. 2003. The influence of source tree on somatic embryogenesis from eastern black walnut (Juglans nigra) immature cotyledons. Acta Hortic. 625:249-252.

Tehami, S.K. Ochi Ardabili, M. Farrokhi, J. 2015. Investigating the effect of plant growth regulators on callus formation of walnut (juglans Regia L.) in vitro conditions. The third scientific research congress of development and promotion of agricultural sciences, natural resources and environment of Iran

Yari, M. B., Gholami, M. and Ezniashri, M. 2011. The effect of sampling time, type and arrangement of explant culture and type of antioxidant on the establishment and growth of Iranian walnut explants in vitro. Journal of Horticultural Sciences of Iran, 42 (2) 141-149.

zaker Bostan Abad S, Bakhshi Khaniki G, Mohsennejad F. Asexual Reproduction of Juglans regia L. by using Growth Regulators of IBA and 2,4-D. NCMBJ. 2012; 2 (5):45-51.

    

 

Investigating the Effect of Growth Regulators on Callus Formation and Vegetative Embryogenesis of Pecan Walnut (Carya illinoensis) Under in Vitro Conditions

 

Mohammad Dali1, Mohammad Motamedi*2 and Shahab Sadat Jafari3 

1Graduated from the Department of Plant Production and Genetics, Ahvaz Branch, Islamic Azad University, Ahvaz, Iran.

2Assistant Professor, Department of Plant Production and Genetics, Shoushtar Branch, Islamic Azad University, Shoushtar, Iran

3Assistant Professor, Department of Plant Production and Genetics, Ahvaz Branch, Islamic Azad University, Ahvaz, Iran.

*Corresponding Author’s Email: [e-mail]

(Received: March. 1, 2024– Accepted: April. 3, 2024)

 

ABSTRACT

 

Walnut (Carya illinoensis) is a plant with a high economic value, and the use of micro propagation techniques will be very effective in the vegetative propagation of uniform superior cultivars and genotypes. In order to optimize walnut tissue culture, in this research, fresh branches of Pekan variety trees were separated and transferred to the laboratory. For sterilization, callus formation and somatic embryogenesis, three experiments were performed with different treatments. Six sterilization treatments in a completely randomized design with 4 replications were considered for this research. In order to obtain callus, DKW culture medium was considered as the basic culture medium. 8 treatments of callus formation were investigated in a completely randomized design in 3 replications. In order to achieve indirect somatic embryogenesis, different combinations of TDZ and NAA were investigated in a completely randomized design in 4 replications. The results of analysis of variance of sterilization data indicated the existence of a significant difference between the mentioned treatments. The results of sterilization treatments showed 20% sodium hypochlorite for 5 minutes along with 70% alcohol for 15 seconds as the best result for sterilization of explants. DKW medium supplemented with 3 mg/L 2, 4-D and 0.5 mg/L NAA gave the best result in callus formation. TDZ in the amount of 6 μM along with NAA in the amount of 0.2 μM had the best results in the embryogenesis of the resulting callus.

Keywords: American walnut, embryogenesis, callus, tissue culture